抗总微管蛋白羊多抗WB&IF应用说明

抗微管蛋白抗体（货号#ATN02）是一种亲和纯化的绵羊多克隆抗体，可对α和β微管蛋白发生反应。用于抗体生产的免疫原是纯化微管蛋白的混合物，因此该抗体具有从酵母到人类的广泛物种交叉反应性。猪提取物（货号#EXT03）作为阳性对照包括在内，ATN02在蛋白质印迹上鉴定出55 kD的特征微管蛋白条带（见图1）。ATN02以冻干白色粉末形式提供。

图1.抗微管蛋白抗体的蛋白质印迹分析。通过电泳分离蛋白质样品并按照方法所述转移到PVDF膜上。将ATN02抗体稀释至50 0 ng/ml （1：1000）进行蛋白质印迹分析。在10μg牛脑提取物中检测到微管蛋白（见55kD处的箭头）。分子量标记物来自Invitrogen。

图2.用抗微管蛋白多克隆抗体探测的细胞提取物的蛋白质印迹（货号#ATN02）。果蝇 S2 细胞提取物（50 μg，泳道 1）、非洲爪蟾 A6 细胞（50 μg，泳道 2）、小鼠瑞士 3T3 细胞（50 μg，泳道 3）、大鼠 NRK 细胞（50 μg，泳道 4）、人 HeLa 细胞（50 μg，泳道 5）和牛脑（50 μg，泳道 6）提取物中微管蛋白的化学发光检测在 55 kD（见箭头）。用500 ng/ml（1：1000）稀释的ATN02探测印迹。

储存和重组：

在环境温度下运输。冻干蛋白可在4℃下干燥保存6个月。对于重构，应短暂离心产品管，以收集管底部的粉末。

将每根试管在100μl Mili-Q水加30%甘油中重新配制，并在4℃下储存长达一个月。为防止细菌在4℃下生长，添加50μg/ml硫酸庆大霉素或其他抗菌剂。对于超过一个月的储存，抗体应等分并在70°C下储存。

将脑提取物阳性对照蛋白重新悬浮在500μl 1x SDS-PAGE样品加载缓冲液中，最终浓度为2 mg/ml，等分为20 X 25μl量（各50μg），并在20°C下储存。

艾美捷抗总微管蛋白羊多抗蛋白质印迹（WB）应用：

按照1:1000稀释度的方法使用，足够200 ml的工作强度Ab。

Western印迹法：

1.在SDS-PAGE上运行蛋白质样品和对照样品。

2.在电印迹之前，在室温下将凝胶在蛋白质印迹缓冲液（25mM Tris pH 8.3，192mM甘氨酸，5%甲醇）中平衡15分钟。

3.在75V下将蛋白质转移到PVDF膜上60分钟，或在20V下4℃下过夜。

4.用TBST洗涤膜一次10分钟（10mM Tris-HCl pH 8.0150mM NaCl，0.05%吐温20）。

5.在室温下，在持续搅拌的情况下，用TBST中的5%脱脂奶粉封闭膜表面30分钟。

6.将膜与在TBST/1%脱脂乳中稀释的ATN02抗体的1:1000稀释液在室温下孵育1h或在4°C下持续搅拌过夜。

7.在TBST中洗涤膜3次，每次5分钟。

8.我在室温下用TBST/1%脱脂乳中的抗绵羊二级抗体的适当稀释液（例如1:20000）对膜进行浸泡60分钟。

9.在TBST中洗涤膜6次，每次10分钟。

10.使用增强化学发光检测方法来检测信号

（例如，SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate；ThermoFisher）。

IF方法：

1.在玻璃盖玻片上培养组织培养细胞，使其达到所需的融合度。

2.取出培养基，用isotemp PBS（37℃）轻轻清洗细胞一次。

3.用甲醇在-20°C下固定细胞3分钟。

4.用PBS洗涤细胞三次。

5.将盖玻片的细胞面朝上放在培养皿内的石蜡膜上。在有盖的培养皿里放一张湿滤纸，以保持潮湿的空气。向每个盖玻片中加入100μl渗透缓冲液（1%Triton X-100，PBS），孵育20分钟。

6.去除渗透缓冲液，加入100μl块缓冲液（PBS中的3%BSA），并培养30分钟。

7.用PBS清洗盖玻片一次。

8.将100-200μl 1:500稀释的ATNO2抗体在封闭缓冲液中加入到每张盖玻片中。

9.在渗透缓冲液中洗涤每个盖玻片三次（孵育5分钟）。

10.在封闭缓冲液中向每张盖玻片中加入200μl 1:500稀释的罗丹明缀合的抗绵羊抗体。培养30分钟。

11.将每个盖玻片在PBS中洗涤三次（每次静置5分钟）。

12.在PBS中用200μl的100nM DAPl对DNA进行反染色5分钟。

13.将盖玻片倒置在载玻片上的一滴防褪色安装介质上。用纸巾轻轻地去除多余的培养基，让安装的培养基干燥。

14.使用配备有适用于罗丹明和DAPI荧光团的过滤装置的荧光显微镜检查染色的盖玻片。

15.将幻灯片保存在4摄氏度的黑暗中。

16.典型结果如图2所示。

Cytoskeleton公司成立于1993年，专注于生物化学和细胞过程研究中的纯化蛋白和便捷试剂盒开发与生产。公司提供药物筛选、信号转导、蛋白质转录后修饰（PTM）、细胞骨架研究相关的系列试剂盒和产品，尤其以细胞骨架相关研究见长，既能满足于样品较少的科学研究，也可以用于小规模筛选研究和高通量大规模筛选研究。此外，公司还提供微管蛋白，肌动蛋白，小G蛋白，GAPs，GEFs等现有产品的药物筛选服务。