预活化，APC-AF750：更高的FRET效率和信号

异藻蓝蛋白（APC）是从螺旋藻中分离得到的一种藻胆蛋白。与其他藻胆蛋白一样，APC表现出荧光，并具有高消光系数和量子产率。它可以使用传统的蛋白质交联技术与抗体和其他蛋白质偶联，而不会改变其光谱特性。其在633nm和647nm处的强吸收使其及其串联物成为流式细胞术应用中与红色激光结合使用的首选荧光染料之一。APC-AF700和APC Alexa Fluor 700串联染料具有相同的结构。它们的主要吸收峰在651nm处，发射峰在710nm附近。APC-AF750串联是APC-Cy7的一个极好的替代品，提供更高的FRET效率和信号。它的主要吸收峰在651nm，发射峰在780nm附近

艾美捷预活化，APC-AF750：

Cat #: 目录号：B-CHM310/B-CHM316/B-CHM317

规格：1 mg

储存：储存温度为4°C，避光。

形式：解决方案激光：Laser633

储存条件：储存温度为4°C，避光保存，不得冷冻。

稳定性：在适当的储存条件下稳定至少6个月。

预活化，APC-AF750使用说明：

1.抗体修饰

1） 将抗体修饰试剂（DTT/TCEP）溶于ddH20中，制备2mg/ml抗体修饰缓冲液。

2） 使用PBS缓冲液将待标记抗体的浓度（纯度>90%）调节至约5-10 mg/ml。向每毫克抗体中加入10μl抗体修饰缓冲液，轻轻混合。在室温下搅拌混合物60-90分钟。

3） 反应完成后，将混合物转移到离心过滤管中，并加入MES缓冲液。离心过滤器多次以除去过量的抗体修饰缓冲液。过滤器中收集的溶液是经修饰的抗体，应将其调节至1-5mg/ml的浓度。

2.APC串联激活

1） 将APC串联溶于浓度为5-10mg/ml的0.1M PBS（pH 7.4，5mM EDTA）中。

2） 将SMCC溶解在无水二甲基亚砜中，制备10mg/ml的储备溶液。

3） 每mg APC串联染料添加5ul的SMCC（n（APC串联）：n（SMCC）=1:80）。用铝箔密封反应混合物，并在室温下旋转1小时，以使APC串联上的氨基与琥珀酰亚胺酯反应，形成衍生的APC串联。

4） 反应完成后，将反应混合物转移到超滤离心管中，并在4℃、12000g下离心5分钟以除去滤液。加入500μl MES缓冲液，混合并离心。重复此步骤5次。

5） 收集活化的APC串联溶液。

3.活化的APC串联与抗体的结合

1） 使用MES缓冲液将活化APC串联的浓度调节至5 mg/ml。为了获得活化APC串联的准确重量，我们建议使用活化APC串联形式测量的消光系数（[APC串联]=0.14999×A651，其中[APC串联]是以mg/ml为单位的浓度，A651是651nm处的吸光度，优选在0.3-0.8的范围内）。

2） 将修饰的抗体与活化的APC串联以1:1.3的质量比混合（每mg修饰的抗体1.3 mg活化的APC串列）。在室温下进行反应，避光2小时。

3） 将NEM溶解在无水二甲基亚砜（DMSO）中，制备12.5 mg/ml溶液（0.1 M）。每毫克抗体向步骤2）的反应混合物中加入5μl的-NEM溶液，以阻断任何剩余的活性基团。

4） 将步骤3）中的溶液转移到离心过滤管中，并通过重复离心去除阻塞缓冲液。

5） 将标记的抗体分成等分，添加适当的防腐剂，并在-20°C下储存以备将来使用。

注意事项：

1.激活的APC串联应在黑暗中冷藏。在贴标签的过程中，应尽可能避免光线照射。

2.封闭试剂和修饰试剂应新鲜配制，并立即使用。它们不应该存放很长时间。

3.标记的抗体应具有高特异性和不低于90%的纯度。单克隆抗体是首选，溶液中不应含有游离胺。最好使用PBS。在标记之前，抗体应该耗尽NaN3和BSA。透析、浓缩和浓度测量等操作可能会导致抗体损失。因此，应根据具体情况确定用于标记的抗体的适当量。

4.由于修饰抗体中引入的基团对再氧化的易感性，修饰后的抗体应尽快与活化的APC串联偶联。

APC-AF750:

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