ALPCO-超敏胰岛素ELISA检测原理&结果计算

ALPCO超敏胰岛素ELISA用于定量测定人血清和血浆中的胰岛素。

艾美捷超敏胰岛素ELISA（ALP-80-CPTHU-E01.1）检测原理：

ALPCO超敏感胰岛素ELISA是一种夹心型免疫分析法。96孔微孔板涂有针对胰岛素的单克隆抗体。标准品、样本和对照品与检测抗体一起加入微孔板孔中。然后，微孔板在室温下以700-900转每分钟的速度在微孔板振荡器上孵育。第一次孵育完成后，用洗涤缓冲液清洗孔并吸干。加入TMB底物，微孔板在室温下第二次在微孔板振荡器上以700-900转每分钟的速度孵育。第二次孵育完成后，加入停止溶液，并通过分光光度计在450 nm处测量光密度（OD）。产生的色度强度与样本中胰岛素的含量成正比。

供应的材料：

Component Quantity Preparation

Insulin Microplate (96 wells) 12x8 strips Ready to use

Zero Standard (0 μlU/mL) 5 mL Ready to use

"Standards  (A-E)

(0.15,1,3,10,20  μlU/mL)" 1 mL each Ready to use

Diabetes Control Level 1* 1 vial each Lyophilized*

Detection Antibody 12 mL Ready to use

Wash Buffer Concentrate 40 mL 21X

TMB Substrate 12 mL Ready to use

Stop Solution 12 mL Ready to use

Plate Sealers 3 Ready to use

**请参阅每个试剂盒随附的分析证书，了解批次特定的控制范围和复溶量。

超敏胰岛素ELISA测定程序：

使用前应将所有试剂和微孔板条平衡至室温（18-25°C）。使用前轻轻混合所有试剂。每次测定运行和每次使用多个微孔板时，都必须进行标准曲线测定。所有标准品、样本和对照品都应双重测定。

1. 在打开铝箔袋之前，应将微孔板平衡至室温。为标准品、对照品和样本的双重测定准备足够的微孔板条。剩余的微孔板条应存放在含有干燥剂的紧闭铝箔袋中，储存在2-8°C。

2. 分别向各自孔中移液25 ?L的标准品、对照品和样本。参见试剂准备和分析证明书中的对照品重组说明。

3. 向每个孔中移液100 ?L的检测抗体。

4. 用板封膜覆盖微孔板，在室温下振荡孵育1小时，振荡速度为700-900 rpm。

5. 倒掉孔中的内容物，并使用微孔板洗涤器每次用350 ?L的工作强度洗涤缓冲液洗涤微孔板6次（参见试剂准备）。或者，使用配备洗涤喷嘴的洗涤瓶将工作强度洗涤缓冲液注入孔中。（不建议使用多通道移液器。必须用足够且相等的力量分配洗涤缓冲液，以便正确洗涤孔。）在洗涤之间，将微孔板倒置以丢弃液体，并在吸水纸上用力拍打倒置的微孔板。在最后一次洗涤后（自动或手动），通过倒置并在吸水纸上用力拍打微孔板，从孔中去除任何残留的洗涤缓冲液和气泡。

6. 向每个孔中移液100 ?L的TMB底物。

7. 用板封膜覆盖微孔板，在室温下振荡孵育30分钟，振荡速度为700-900 rpm。

8. 向每个孔中移液100 ?L的停止溶液，并轻轻摇晃微孔板以混合内容物。在进行下一步之前去除任何气泡。

9. 将微孔板放入能够读取450nm吸光度的微孔板读取器中。在加入停止溶液后应立即分析微孔板，且不得超过30分钟。

超敏胰岛素ELISA结果计算：

从标准品构建标准曲线。零标准品应作为空白，其平均值应从每个孔中减去。建议使用软件程序计算标准曲线并确定样本的浓度。ALPCO超敏感胰岛素ELISA是一种配体结合测定法，其响应与分析物浓度呈S形关系。目前接受的此类曲线的参考模型使用4或5参数逻辑（pl）拟合，因为这些模型在更大范围内优化了准确性和精确性。尽管三次样条和其他模型是可接受的方法，但它们通常在低高端的范围内显示出较低的测定内准确性和精确性。

在以下示例中，使用了5-pl曲线拟合，以最大化低浓度样本的准确性和精确性。然而，由于个别实验室条件的影响，所有模型在可检测范围的最低和最高端的准确性和精确性都是有限的。因此，在解释分析物响应变得非线性的结果时，应始终谨慎。

典标准曲线：

以下结果仅用于演示目的，不能代替通过测定获得的数据。

超敏胰岛素ELISA文献参考：

Finlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 2007; 9(2): E260-E267.