ALPCO IgE(小鼠)ELISA, 96孔检测原理和操作步骤说明

IgE检测试剂盒是一种高灵敏度的双位点酶联免疫测定法（ELISA），用于测量小鼠血清和血浆样本中的IgE。

作为ALPCO在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐ALPCO热销产品IgE(小鼠)ELISA, 96孔。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

IgE(小鼠)ELISA, 96孔检测原理：

双抗体夹心酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理如图1所示。在这个检测中，样本中存在的IgE与已经吸附在聚苯乙烯微孔板表面的抗IgE抗体发生反应。洗涤去除未结合的蛋白质后，加入与辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗IgE抗体。这些酶标记的抗体与之前结合的IgE形成复合物。经过另一次洗涤步骤，通过添加显色底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）来检测与免疫吸附剂结合的酶。结合酶的量与被测试样本中IgE的浓度成正比；450纳米处的吸光度是测试样本中IgE浓度的量度。测试样本中的IgE量可以通过从标准品构建的标准曲线进行插值，并根据样本稀释进行校正。

试剂（足够进行96次测定的数量）

稀释液浓缩液（测定缓冲液） 一瓶含有50 mL的5倍浓缩稀释测定缓冲液。

洗涤液浓缩液 一瓶含有50 mL的20倍浓缩洗涤液。

酶-抗体结合物 100倍 一瓶含有150 ?L的亲和纯化的抗小鼠IgE抗体与辣根过氧化物酶结合的稳定缓冲液。

显色底物溶液 一瓶含有12 mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和过氧化氢在柠檬酸缓冲液中，pH值为3.3。

终止液 一瓶含有12 mL的0.3 M硫酸。警告：避免与皮肤接触。

抗小鼠IgE ELISA微孔板 十二个可移动的八孔条在孔架框中。每个孔都涂有亲和纯化的抗小鼠IgE。

小鼠IgE校准物 一瓶含有冻干的小鼠IgE校准物。

试剂准备

稀释液浓缩液 提供的稀释液是5倍浓缩液，必须用蒸馏水或去离子水按1:5稀释（1份缓冲液浓缩液，4份去离子水）。

洗涤液浓缩液 提供的洗涤液是20倍浓缩液，必须用蒸馏水或去离子水按1:20稀释（1份缓冲液浓缩液，19份去离子水）。当储存温度较低时，浓缩液中出现结晶并不罕见。在稀释前将浓缩液加热至30-35°C可以溶解结晶。

酶-抗体结合物 通过向每个微孔板测试条添加10 ?L酶-抗体结合物至990 ?L的1X稀释液中，计算每个微孔板测试条所需的工作结合物溶液量。均匀混合，但要轻柔。避免起泡。

显色底物溶液 按提供的状态即开即用。

终止液 按提供的状态即开即用。

抗小鼠IgE ELISA微孔板 按提供的状态即开即用。揭开微孔板袋，从袋中取出板。移除在测定中不会使用的条和孔，放回袋中并重新密封，连同干燥剂。

小鼠IgE校准物 向小鼠IgE校准物中加入1.0 mL的蒸馏水或去离子水，轻轻混合直至溶解。校准物现在的浓度为1.875 ?g/mL（如果打算将来使用，重组的校准物应分装并冷冻）。小鼠IgE标准品需要在立即使用前准备。每步之间混合良好。避免起泡。

操作步骤

1. 使用前将所有试剂置于室温下。

2. 分别向以下标准品孔中移液100 μL（每个标准品做两份）：

标准品0（0.0 ng/mL）

标准品1（6.25 ng/mL）

标准品2（12.5 ng/mL）

标准品3（25 ng/mL）

标准品4（50 ng/mL）

标准品5（100 ng/mL）

标准品6（200 ng/mL）

标准品7（400 ng/mL）

3. 向预先指定的孔中移液100 μL的样本（每个样本做两份）。

4. 在室温下孵育微孔板三十（30 ± 2）分钟。孵育期间保持板盖覆盖并保持水平。

5. 孵育后，抽吸掉孔中的内容物。

6. 用适当稀释的洗涤液完全填满每个孔并抽吸。重复三次，总共进行四次洗涤。如果手动洗涤：用洗涤缓冲液完全填满孔，倒置板子然后将内容物倒入废液容器。接着用吸水纸迅速拍打孔以去除残留的缓冲液。重复三次，总共进行四次洗涤。

7. 向每个孔中移液100 μL适当稀释的酶-抗体结合物。在室温下孵育三十（30 ± 2）分钟。孵育期间保持板盖覆盖，避光并保持水平。

8. 如步骤5和6所述洗涤和吸干孔。

9. 向每个孔中移液100 μL的TMB底物溶液。

10. 在暗处室温下精确孵育十分钟（10）。

11. 十分钟后，向每个孔中加入100 μL的终止液。

12. 测定每个孔内内容物的吸光度（450 nm）。根据制造商的规格校准板读数器。

ALPCO产品种类多样，可测样品来源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、猪、羊、狗、猴等，涉及神经生物学、骨代谢、心血管疾病和氧化应激、细胞因子与信号转导、糖尿病和肥胖症、内分泌学、甲状腺功能、肠胃病学、免疫学、生殖激素、抗体和抗原、分子诊断等多个研究领域，尤以糖尿病和肥胖症研究领域见长。

作为ALPCO在中国区域的代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的ALPCO产品。