ALPCO Vaspin ELISA, 96孔，优化的实验设计用于快速筛查Vaspin表达水平变化

用于定量测量Vaspin的酶联免疫吸附测定（ELISA）是基于通过遗传免疫接种兔子（cDNA Vaspin SC306941）产生的多克隆兔抗血清。Vaspin，也称为SerpinA12，是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，由395个氨基酸组成，形成3个β-折叠和9个α-螺旋。Vaspin的分子量约为45.2 kDa。它不形成多聚体聚集体或分子内二硫键，并且已知在人血清中没有结合蛋白。Vaspin基因不仅在皮下和内脏脂肪组织中表达，还在肝脏组织、胰腺1和人表皮（颗粒层角质形成细胞/GK细胞）中表达。“血清Vaspin水平在早餐前早晨最高，并且在早餐后2小时内降至最低水平。血清Vaspin水平在午餐和晚餐前也显示出餐前上升和餐后下降，尽管程度小于早餐。餐间Vaspin浓度在下午中期达到最低点，并在夜间上升，夜间Vaspin水平的峰值约为最低点水平的250%。在长时间禁食后不规律进食显著降低了血清Vaspin水平，这表明能量摄入本身对血清Vaspin水平有抑制作用。血清Vaspin浓度的昼夜模式与胰岛素和葡萄糖的模式完全相反”。

作为ALPCO在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐ALPCO热销产品Vaspin ELISA, 96孔。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

方法

Vaspin的酶免疫测定是一种所谓的夹心测定法。它利用针对这种蛋白的特异性和高亲和力的多克隆抗体。样本中的Vaspin与微孔板上固定的第一抗体结合。随后，生物素标记的抗体转而与Vaspin结合。洗涤后，将添加链霉亲和素-过氧化物酶-酶结合物，它将高度特异性地与生物素结合，并催化酶反应，根据样本中Vaspin水平的多少，定量地改变底物的颜色。

样本

血清样本可用于此测定法。

样本储存

建议将样本储存在-20°C的紧闭塑料管中。

样本准备

样本必须用稀释缓冲液（VP）稀释。对于大多数测定（血清样本，且不预期有极端值），使用1:4与稀释缓冲液VP的稀释比例应该是合适的。根据预期的Vaspin水平，可以用VP进行更高或更低的稀释。这个测试系统的卓越线性允许样本稀释从1:2到1:32。人体来源的体液中的Vaspin浓度可能与血清或细胞培养上清完全不同。

稀释建议方案：

在PE/PP管中移液210 ?l稀释缓冲液VP（在大量系列中推荐使用多步移液器），加入70 ?l血清或血浆（稀释1:4）。混合后，每次测定使用100 ?l此稀释液。

技术建议

不能混合不同批号的试剂。如果储存在2 – 8°C、未开封并避免阳光直射，所有试剂和微孔板都稳定直至标示的有效期。如果适当使用，开封后组分的保质期为4周。使用前将所有试剂置于室温（20 - 25°C）。缓冲液中可能的沉淀在使用前必须通过混合和/或加热溶解。室温孵育意味着：20-25°C。

特异性：

通过两种不同的方法研究了所用多克隆抗体的特异性。通过尺寸排除色谱法分离了原生血清样本中的蛋白质，得到的分数进行了a) ELISA检测，以及b) ELISA阳性的分数也通过西方印迹法进行了测试。图2显示ELISA在大约37 kDa处检测到一个信号，这一点通过西方印迹法得到了确认。理论上，Vaspin的分子量为45.2 kDa。与重组Vaspin相比，SEC峰分数的信号大小相同。计算出的分子量的差异可能是由于柱子校准的可变性以及SEC条件的差异，如分数大小和流速造成的。

图：Vaspin ELISA的特异性。将250?L人血清通过SEC Superdex 10/300GL进行分离，分数大小为0.5 ml，流速为0.5 ml/min。样本用稀释缓冲液稀释至1:4。插图显示了西方印迹法的结果，样本通过10% SDS-PAGE分离、转移，并用生物素标记的抗体（1:1000）和链霉亲和素-过氧化物酶结合物（1:1500）染色。

文献参考：

1. Korner, A. et al. Vaspin is related to gender, puberty and deteriorating insulin sensitivity inchildren, Int J Obes 35, 578–586 (2011).

2. Toulza, E. et al. Large-scale identification of human genes implicated in epidermal barrierfunction, Genome Biol 8, R107 (2007).

3. Jeong, E. et al. Circadian Rhythm of Serum Vaspin in Healthy Male Volunteers: Relationto Meals, Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 95, 1869–1875 (2010).

4. Loeffelholz, C. v. et al. Circulating vaspin is unrelated to insulin sensitivity in a cohort ofnondiabetic humans, European Journal of Endocrinology 162, 507–513 (2010).

5. Zhang, L. Li, L. Yang, M. Liu, H. & Yang, G. Elevated circulating vaspin levels weredecreased by rosiglitazone therapy in T2DM patients with poor glycemic control onmetformin alone, Cytokine (2011). 

ALPCO产品种类多样，可测样品来源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、猪、羊、狗、猴等，涉及神经生物学、骨代谢、心血管疾病和氧化应激、细胞因子与信号转导、糖尿病和肥胖症、内分泌学、甲状腺功能、肠胃病学、免疫学、生殖激素、抗体和抗原、分子诊断等多个研究领域，尤以糖尿病和肥胖症研究领域见长。

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