ALPCO 肾素活性LIA, 2 × 96孔：测定程序和计算方法说明

肾素活性LIA用于通过化学发光免疫测定法定量测定人血浆中的肾素活性（PRA）。此套件仅供研究使用。不适用于诊断程序。

作为ALPCO在中国的区域总代理，艾美捷科技强烈推荐ALPCO热销产品肾素活性LIA, 2 × 96孔。产品仅用于科研，不可用于临床诊断。

检测原理：

该试剂盒测量血浆肾素活性，结果以每单位时间每单位体积人血浆产生的血管紧张素-I（Ang-I）的质量（ng/mL.h）表示。血液样本收集在含有EDTA的试管中。血浆被分离出来，或者冷冻保存，或者在室温下保存以供立即使用。在pH值调节之前，在收集或处理过程中，不应将样品一次性冷却或储存在0至10°C的温度下，因为这可能会导致对肾素活性的过高估计。在免疫测定开始之前，将蛋白酶抑制剂和生成缓冲液添加到血浆样本中，这将防止血浆中的血管紧张素-I（Ang-I）降解。加入所提供的生成缓冲液后，血浆样品的pH值应在6.0左右。血浆样本分为两部分，分别在0-4°C（冰浴）和37°C下孵育90分钟或更长时间，以使血浆肾素在37°C时产生Ang-I。可选地，pH值可以调节到6.5或7.4。pH值的调节是测定过程中的关键步骤，将血浆酸化至pH 3.3或更低并持续较长时间，随后恢复到中性pH值会导致肾素的可逆激活（Derkx等人，1987），另一方面，在pH值高于8.0的条件下孵育会破坏肾素。在免疫测定培养过程中，涉及另一组蛋白酶抑制剂，其作用是阻止新一代Ang-I降解为小肽。Ang-I的免疫测定是一种竞争性检测，使用两次孵育，总检测孵育时间不到两小时。在第一次孵育期间，未标记的Ang-I（存在于标准品、对照品和血浆样本中）与生物素化的Ang-I竞争结合抗Ang-I抗体。在第二次孵育中，标记的链霉抗生物素蛋白-HRP偶联物与固定化的Ang-I-Biotin结合。洗涤和滗析程序可以去除未结合的物质。加入发光HRP底物，在酰胺酶标仪中测量产生的光（RLU）。RLU值与样品中Ang-I的浓度成反比。使用一组校准器绘制标准曲线，从中可以直接读取样品中AngI的浓度。

测定程序：

1. 使所有试剂盒组分达到室温。取出所需数量的微孔条并装配到板架上。

2. 将每个校准品、对照品和处理过的血浆样本（37°C和0°C的等分）50 ?L分别加入相应标记的孔中，每个样品做两份。

3. 向每个孔中加入100 ?L的血管紧张素I-生物素结合物（推荐使用多通道移液管）。

4. 在平板振荡器上（大约200转/分钟）在室温下孵育60分钟。

5. 用稀释洗涤缓冲液清洗孔5次，每次每孔300 ?L。清洗后，将板子用力拍打在吸水纸上以去除残留液体（推荐使用自动条带清洗器）。正确执行洗涤程序对本测定的性能有显著影响。

6. 向每个孔中加入150 ?L的链霉亲和素-HRP结合物工作溶液（推荐使用多通道移液管）。

7. 在平板振荡器上（大约200转/分钟）在室温下孵育30分钟。

8. 用稀释洗涤缓冲液清洗孔3次，每次每孔300 ?L（推荐使用自动条带清洗器）。

9. 用蒸馏水或去离子水冲洗孔3次，每次每孔300 ?L。冲洗后，将板子用力拍打在吸水纸上以去除残留液体（推荐使用自动条带清洗器）。

10. 向每个孔中加入150 ?L的LIA底物工作溶液（推荐使用多通道移液管）。

11. 在加入底物后的10-30分钟内，在微孔板发光仪上测量每个孔的相对光单位（RLUs）。建议将测量时间设置为每孔1秒。

计算：

1. 使用免疫测定软件，选择4参数或5参数曲线拟合方法来计算结果。

2. 如果样本读数超过60ng/mL，则用校准器A稀释样本，稀释度不超过1:10，并重新运行样本。所得结果应乘以稀释因子。

3. 使用下列公式计算每个样本的血浆肾素活性（PRA）：PRA = [37°C的Ang-I] – [0°C的Ang-I] x 1.11 时间（小时）

其中时间（小时）是在生成步骤中使用的孵育时间。

典型校准器曲线

仅示例曲线。请勿用于计算结果。

文献参考：

1.Brossaud,J.,Corcuff JB.Clin.Chim.Act.410:90,2009

2.Bystrom CE et al.,Clin Chem,56:XXX,2010

3.Campbell,DJ,et al.,Clin.Chem.55:867,2009.

4.Cartledge,S.,Lawson,N.,Ann.Clin.Biochem.37:262,2000.

5.Derkx FH et al,J Biol Chem,262:2472,1987.

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7.Pimenta E,Calhoum D,Hypertension,55:e17,2010.

8.Reudelhuber,TL,Hypertension,55:1071,2010.

9.Sealey,JE,J.Hypertension,13:27,1995.

10.Sealey,JE,Clin.Chem.37/10(B):1811,1991.

11.Sealey et al.,Trends Endocrin Metab,16:86,2005.

12.Ulmer PS,Weikle AW,Clin Chem.46:1442,2000.

ALPCO产品种类多样，可测样品来源包括人、大/小鼠、豚鼠、兔、猪、羊、狗、猴等，涉及神经生物学、骨代谢、心血管疾病和氧化应激、细胞因子与信号转导、糖尿病和肥胖症、内分泌学、甲状腺功能、肠胃病学、免疫学、生殖激素、抗体和抗原、分子诊断等多个研究领域，尤以糖尿病和肥胖症研究领域见长。

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