ALPCO-瘦素ELISA试剂盒检测程序&示例数据

ALPCO-瘦素ELISA试剂盒用于酶免疫测定法定量测定人血清中的瘦素。此套件仅供研究使用。不用于诊断程序。

艾美捷瘦素ELISA试剂盒（ALP-11-LEPHU-E01）检测原理：

以下酶免疫测定的原理遵循典型的两步捕获或“夹心”类型测定。该测定利用两种高特异性的单克隆抗体：一种特异性针对瘦素的单克隆抗体被固定在微孔板，另一种针对瘦素不同表位的单克隆抗体与生物素结合。在第一步中，样本和标准品中存在的瘦素与固定抗体和生物素标记抗体结合，形成夹心复合物。通过洗涤步骤去除过量和未结合的生物素标记抗体。第二步中，添加链霉亲和素-辣根过氧化物酶（streptavidin-HRP），它特异性地与任何结合的生物素标记抗体结合。同样，通过洗涤步骤去除未结合的链霉亲和素-辣根过氧化物酶。接下来，添加酶底物（TMB），形成与存在瘦素量直接成比例的蓝色产物。通过添加停止液终止酶促反应，将蓝色变为黄色。在450纳米处的微孔板读数器上测量吸光度。使用一组标准品绘制标准曲线，从而可以直接读取样本和对照品中瘦素的含量。

瘦素ELISA试剂盒检测程序：

所有试剂在使用前必须达到室温。校准品、对照品和样本应以双份进行检测。一旦开始程序，所有步骤都应连续完成，不得中断。

1. 所有试剂盒组分达到室温后，轻轻倒置混合。

2. 准备1X工作浓度的链霉亲和素-HRP结合物和洗涤缓冲液。

3. 规划微孔板孔，用于校准品、对照品和样本。参见推荐检测布局。移除将不使用的条，并将其放回带有干燥剂的袋子中。重新密封带有未使用条的袋子，并放回冰箱。

4. 将20 μL每种校准品、对照品和血清样本分别准确吸入相应的孔中，每个孔双份。

5. 向每个孔中加入80 μL单克隆抗瘦素-生物素结合物。建议使用多通道移液管。

6. 在室温下，以3毫米直径的微孔板振荡器（大约600转每分钟）孵育1小时。

7. 使用自动微孔板洗涤器（首选）或按以下方法手动洗涤微孔板孔。自动：使用自动微孔板洗涤器，执行3周期洗涤，每孔使用300?L 1X工作洗涤缓冲液（3 x 300 ?L）。一个周期包括吸取所有孔，然后用300 ?L 1X工作洗涤缓冲液填充每个孔。在最后一次洗涤周期后，吸取所有孔，然后将微孔板牢固地敲击在吸水纸上以去除任何残留液体。手动：手动洗涤时，执行3周期洗涤，每孔使用300 ?L 1X工作洗涤缓冲液（3 x 300 ?L）。一个周期包括通过迅速清空孔中内容物到废液容器来吸取所有孔，然后使用多通道移液管向每个孔中加入300 ?L 1X工作洗涤缓冲液。在最后一次洗涤周期后，通过迅速清空孔中内容物到废液容器来吸取所有孔，然后牢固地敲击微孔板以去除任何残留液体。

8. 向每个孔中加入100 μL 1X工作链霉亲和素-HRP结合物。建议使用多通道移液管。

9. 在室温下，以3毫米直径的微孔板振荡器（大约600转每分钟）孵育30分钟。

10. 按照步骤7同样的方式再次洗涤微孔板孔。

11. 在定时间隔向每个孔中加入100 ?L TMB底物。建议使用多通道移液管。

12. 在室温下，以3毫米直径的微孔板振荡器（大约600转每分钟）孵育10-15分钟。

13. 在与步骤11相同的定时间隔向每个孔中加入50 μL停止液。建议使用多通道移液管。轻轻敲击微孔板框架以混合孔中的内容物。

14. 在加入停止液后20分钟内，使用设定为450纳米的吸光度微孔板读数器测量微孔板孔中的光密度（吸光度）。

典型表格数据：

仅提供示例数据。请勿用于计算结果。