C-反应蛋白（hsCRP）ELISA检测原理&分析程序

C-反应蛋白（CRP）ELISA是一种测定CRP的定量免疫测定法，在人血清中。仅供研究使用。不用于诊断或治疗程序。

艾美捷C-反应蛋白（hsCRP）ELISA（ALP-11-CRPHU-E01）检测原理：

CRP ELISA是一种两步捕获或“夹心”类型的免疫测定。该检测使用两种高度特异性的单克隆抗体：一种特异性针对CRP的单克隆抗体固定在微孔板上，另一种针对CRP不同表位的单克隆抗体与辣根过氧化物酶（HRP）结合（HRP结合物）。在第一次孵育步骤中，样本、校准品和对照品中存在的CRP被固定在微孔板上的抗体所结合。通过洗涤步骤去除多余的和未结合的物质。

在第二次孵育步骤中，添加HRP结合的抗体（HRP结合物），它特异性地结合到任何固定的CRP上，形成夹心复合物。通过洗涤步骤去除未结合的HRP结合物。接下来，添加TMB底物（酶底物）并与HRP反应形成蓝色产物，其颜色的深浅与样本中存在的CRP量成正比。通过添加停止溶液来终止酶促反应，将颜色从蓝色变为黄色。在450 nm处使用微孔板读取器测量吸光度。使用一组校准品绘制校准曲线，从而可以直接读取样本和对照品中CRP的含量。

C-反应蛋白（hsCRP）ELISA分析程序：

注：所有样品在测试前必须进行预处理（见样品预处理和储存第节）。不要对校准器和试剂盒控件进行预处理，因为它们是现成的。所有试剂和样品在使用前必须达到室温。校准器、控制装置和样品应一式两份进行化验。一旦程序开始，所有步骤都应该不间断地完成。

1. 所有试剂盒组分达到室温后，轻轻倒置混合。

2. 准备1倍工作HRP结合物和1倍工作洗涤缓冲液。

3. 准备待测的血清样本（见样本预处理及储存部分）。

4. 从微孔板中取出所需数量的条带，并组装成板架。将未使用的条带放回带有干燥剂的袋子中，重新密封，并存放在冰箱中。

5. 将每个校准品、对照品和预处理样本的20 ?L分别加入指定孔中，并进行复孔操作。

6. 向每个孔中加入200 μL的检测缓冲液（推荐使用多通道移液器）。

7. 在室温下，放在微孔板摇床上孵育30分钟（往复式摇床约180次/分钟或轨道式摇床约600转/分钟）。

8. 使用自动微孔板洗涤器（首选）或按以下方法手动洗涤微孔板。

自动：使用1倍工作洗涤缓冲液（每孔300 ?L）进行3周期洗涤（3次300 ?L）。一个周期包括吸去所有孔中的液体，然后每个孔中注入300 ?L的1倍工作洗涤缓冲液。在最后一次洗涤周期后，吸去所有孔中的液体，然后将板子牢固地拍打在吸水纸上以去除残留液体。

手动：使用1倍工作洗涤缓冲液（每孔300 ?L）进行3周期洗涤（3次300 ?L）。一个周期包括通过将孔中的内容迅速倒入废液容器来吸去所有孔中的液体，然后使用多通道移液器向每个孔中注入300 ?L的1倍工作洗涤缓冲液。在最后一次洗涤周期后，通过将孔中的内容迅速倒入废液容器来吸去所有孔中的液体。将板子牢固地拍打在吸水纸上以去除残留液体。

9. 向每个孔中加入100 ?L的1倍工作HRP结合物（推荐使用多通道移液器）。

10. 在室温下，放在微孔板摇床上孵育15分钟（往复式摇床约180次/分钟或轨道式摇床约600转/分钟）。

11. 按照步骤8中的方法再次洗涤微孔板孔。

12. 向每个孔中加入100 ?L的TMB底物（推荐使用多通道移液器）。

13. 在室温下，放在微孔板摇床上孵育10-15分钟（往复式摇床约180次/分钟或轨道式摇床约600转/分钟）。

14. 按照加入TMB底物的相同顺序和时间间隔，向每个孔中加入50 ?L的停止溶液（推荐使用多通道移液器）。轻轻拍打微孔板架以混合孔中的内容。

15. 在加入停止溶液后20分钟内，使用设定为450 nm的吸光度微孔板读取器测量光密度（吸光度）。

C-反应蛋白（hsCRP）ELISA典型校准器曲线：

仅示例曲线。不用于计算结果