AAV8滴度检测试剂盒，探究AAV8载体在眼内递送后的免疫反应机制

随着基因治疗技术的快速发展，眼部基因治疗成为治疗遗传性视网膜疾病的一种新兴手段。特别是针对Leber先天性黑矇（Leber Congenital Amaurosis, LCA）等疾病的基因治疗已经取得了显著进展。腺相关病毒（AAV）因其高效性和相对安全性，被广泛用作基因治疗的载体。然而，AAV载体及其转基因产物引发的宿主免疫反应可能会限制治疗效果。“Host Immune Responses after Suprachoroidal Delivery of AAV8 in Nonhuman Primate Eyes”聚焦于经脉络膜上腔递送AAV8载体后的宿主免疫反应，特别是其对非人灵长类动物（NHP）眼中的绿色荧光蛋白（GFP）转基因表达的影响。

方法

1. AAV8载体生产及眼内注射：研究团队使用了携带增强型GFP的AAV8载体，并进行包装和纯化。在动物镇静后，使用30号微针将AAV8注射到NHP的脉络膜上腔或玻璃体内。为了比较不同注射途径对免疫反应的影响，研究设计了三种注射方案：双侧脉络膜上腔注射、脉络膜上腔与视网膜下联合注射、以及双侧玻璃体内注射。

2. 眼部成像：所有动物在注射前后均进行了扫描激光检眼镜（SLO）和光谱域光学相干断层扫描（SD-OCT）成像，以监测转基因表达情况和眼部炎症变化。成像数据通过Spectralis HRA+OCT设备捕获，并分析视网膜形态和荧光表达情况。

3. 免疫反应评估：体液免疫反应：通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中的抗AAV8和抗GFP抗体水平。特别是，研究使用了PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit（货号：PRAAV8），该试剂盒专门设计用于AAV8滴度的定量检测，确保了抗体检测的准确性和特异性。该方法通过夹心法检测血清中针对AAV8衣壳的抗体，为评估AAV8载体引发的体液免疫反应提供了有力工具；细胞免疫反应：通过酶联免疫斑点试验（ELISpot）检测外周血单核细胞（PBMCs）和脾细胞中的干扰素γ（IFN-γ）分泌细胞，以评估T细胞对AAV8衣壳和GFP的反应；生物分布分析：使用定量聚合酶链反应（qPCR）检测肝脏、脾脏和肾脏中的GFP转基因序列，以评估AAV8载体的系统生物分布情况；免疫组化分析：通过免疫组化技术检测眼部组织中GFP表达及免疫细胞浸润情况，进一步确认局部免疫反应。

PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit

实验结果

1. 转基因表达与眼部炎症：脉络膜上腔注射AAV8后，在1个月时观察到广泛的GFP表达，但随着时间的推移，GFP表达逐渐局限于巩膜成纤维细胞。高剂量脉络膜上腔注射后，部分动物出现了轻度前葡萄膜炎和脉络膜视网膜炎，经系统糖皮质激素治疗后得到缓解。相比之下，视网膜下注射和玻璃体内注射的炎症反应较轻。

2. 体液免疫反应：ELISA结果显示，脉络膜上腔注射AAV8后，动物产生了针对GFP的显著抗体反应，但针对AAV8衣壳的抗体反应较弱。相比之下，玻璃体内注射AAV8引发了更强的针对AAV8衣壳的体液免疫反应。这表明脉络膜上腔注射可能减少了AAV8衣壳向循环系统的暴露，从而降低了体液免疫反应。

3. 细胞免疫反应：通过ELISpot和流式细胞术分析，发现脉络膜上腔注射AAV8后，PBMCs和脾细胞对GFP产生了强烈的T细胞反应，而对AAV8衣壳的反应较弱。这进一步支持了脉络膜上腔注射可能减少了针对AAV8衣壳的细胞免疫反应。

4. 生物分布：qPCR分析显示，脉络膜上腔注射后AAV8在脾脏和肝脏中的分布低于玻璃体内注射，这解释了脉络膜上腔注射引发的体液免疫反应较弱的原因。

本研究表明，脉络膜上腔注射AAV8载体在NHP眼中能够引发广泛的转基因表达，但引发的宿主免疫反应相对较弱。特别是对AAV8衣壳的体液和细胞免疫反应显著低于玻璃体内注射，这可能与脉络膜上腔注射减少了AAV8向循环系统的暴露有关。尽管如此，脉络膜上腔注射仍引发了针对转基因产物GFP的显著免疫反应，提示在未来的基因治疗中需要进一步优化载体和转基因设计，以减少免疫反应对治疗效果的影响。PROGEN品牌的AAV8 titration ELISA kit（货号：PRAAV8）在本研究中发挥了重要作用。该试剂盒通过夹心法精确检测血清中针对AAV8衣壳的抗体水平，为评估AAV8载体引发的体液免疫反应提供了可靠的方法。其准确性和特异性确保了研究结果的可靠性，为深入理解AAV8载体在眼内递送后的免疫反应机制提供了有力支持。该试剂盒的应用不仅限于本研究，还可广泛应用于AAV基因治疗相关的基础研究和临床试验中，为评估和优化基因治疗效果提供重要参考。

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