钙离子荧光探针Cal-520，AM：稳健的均相荧光检测工具

钙离子荧光探针Cal-520，AM提供了一种稳健的均相荧光检测工具，用于检测细胞内钙动员。Cal-520 AM是一种新型的荧光发生型钙敏感染料，与现有的绿色钙指示剂（如Fluo-3 AM和Fluo-4 AM）相比，具有显著提高的信噪比和细胞内保留能力。表达感兴趣GPCR或钙通道的细胞，这些通道通过钙信号传导，可以预加载Cal-520 AM，它能够穿过细胞膜。一旦进入细胞内，Cal-520? AM的亲脂性阻断基团被酯酶裂解，产生一种带负电荷的荧光染料，留在细胞内。其荧光在结合钙时大大增强。当细胞被激动剂刺激时，受体会信号释放细胞内钙，这显著增加了Cal-520的荧光。其长波长、高灵敏度和>100倍荧光增强的特性，使Cal-520 AM成为测量细胞钙的理想指示剂。高信噪比和更好的细胞内保留能力使Cal-520钙测定成为评估GPCR和钙通道靶点以及筛选它们的激动剂和拮抗剂的有力工具。

艾美捷钙离子荧光探针Cal-520，AM（AAT-21130）：

制备母液：

除非另有说明，所有未使用的母液应在制备后分装成单次使用的小份，并在-20°C下储存。避免反复冻融。

Cal-520 AM母液

在高质量的无水DMSO中制备2到5 mM的Cal-520 AM母液。

注意：在DMSO中重组时，Cal-520 AM是一种清澈无色的溶液。

制备工作溶液：

Cal-520 AM工作溶液

在实验当天，将Cal-520 AM溶解在DMSO中，或将指示剂母液的小份解冻至室温。

在您选择的缓冲液中（例如，Hanks和Hepes缓冲液）用0.04%的Pluronic F-127制备2到20 ?M的Cal-520 AM工作溶液。对于大多数细胞系，建议使用最终浓度为4-5 μM的Cal-520 AM。细胞加载所需的指示剂的确切浓度必须通过实验确定。

注意：非离子洗涤剂Pluronic F-127有时被用来增加Cal-520 AM的水溶性。可以从AAT Bioquest购买各种Pluronic F-127溶液。

注意：如果您的细胞含有有机阴离子转运体，可能会向染料工作溶液中添加probenecid（1-2 mM）（最终在孔中的浓度将是0.5-1 mM），以减少去酯化指示剂的泄漏。可以从AAT Bioquest购买各种ReadiUse? Probenecid产品，包括水溶性、钠盐和稳定溶液。

样本实验协议：

以下是我们推荐的将AM酯加载到活细胞中的协议。此协议仅提供指导方针，应根据您的具体需求进行修改。

在生长介质中准备细胞过夜。

第二天，向您的细胞板中添加1X Cal-520 AM工作溶液。

注意：如果您的化合物与血清发生干扰，在染料加载前用新鲜的HHBS缓冲液替换生长介质。

将染料加载的板在37°C的细胞培养箱中孵育1到2小时。

注意：孵育染料超过2小时可以提高某些细胞系的信号强度。

用HHBS或您选择的缓冲液（如果适用，含有阴离子转运体抑制剂，如1 mM probenecid）替换染料工作溶液，以去除任何多余的探针。

根据需要添加刺激剂，并同时使用带有FITC滤光片组的荧光显微镜或含有可编程液体处理系统的荧光板读取器（如FDSS、FLIPR或FlexStation）测量荧光，Ex/Em = 490/525 nm截止515 nm。

图1. 在相同条件下，ATP刺激的CHO-K1细胞内源性P2Y受体的钙反应，分别用Cal-520? AM（红色曲线）或Fluo-4 AM（蓝色曲线）处理，并且在左侧有probenecid，右侧则没有。CHO-K1细胞在Costar黑色壁/透明底的96孔板中以每孔100 ?L、50,000个细胞的密度过夜培养。向细胞中加入100 ?L的5 ?M Fluo-4 AM或Cal-520? AM（在HHBS中，含或不含probenecid），并在37°C下孵育1小时。然后使用FlexStation添加ATP（50 μL/孔），以达到最终指示的浓度。

钙离子荧光探针Cal-520，AM文献参考：

Measurement and simulation of myoplasmic calcium transients in mouse slow-twitch muscle fibres

Authors: Hollingworth S, Kim MM, Baylor SM.

Journal: J Physiol (2012): 575

Mononucleated and binucleated cardiomyocytes in left atrium and pulmonary vein have different electrical activity and calcium dynamics

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Changes in serum levels of HBV DNA and alanine aminotransferase determine risk for hepatocellular carcinoma

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Journal: Gastroenterology (2011): 1240

A near-infrared fluorescent calcium probe: a new tool for intracellular multicolour Ca2+ imaging

Authors: Matsui A, Umezawa K, Shindo Y, Fujii T, Citterio D, Oka K, Suzuki K.

Journal: Chem Commun (Camb) (2011): 10407

Application of fluorescent indicators to analyse intracellular calcium and morphology in filamentous fungi

Authors: Nair R, Raina S, Keshavarz T, Kerrigan MJ.

Journal: Fungal Biol (2011): 326