昆虫细胞无血清悬浮生长培养基使用方法详细说明

昆虫细胞无血清悬浮生长培养基--这种产品是无血清的、完全悬浮的细胞培养基，适用于各种细胞系，支持高密度细胞生长。它具有两倍的时间、高活力和与广泛的细胞类型兼容的特点。当与Bac到Bac昆虫细胞表达系统结合使用时，它可以在HiFive和SF9昆虫细胞中高效和稳定地表达多种蛋白质。与Bac和SF9细菌杆状病毒表达系统结合，可以有效和稳定地在HiFivea和SF9害虫细胞中表达多种蛋白质。

艾美捷昆虫细胞无血清悬浮生长培养基基本参数：

货号：A-EXO005

规格：500mL, 1000mL

保存条件: 4℃避光保存；保质期 12 个月。

昆虫细胞无血清悬浮生长培养基使用方法：

昆虫悬浮细胞培养环境

细胞培养条件：温度曲线：27℃±0.5℃、湿度曲线：70%±20%、无需 CO2、120rpm（振幅：25）。培养过

程中需注意以下三点：

1） 保证摇床 24 小时正常运转；

2） 防止外界环境温度过高，导致培养箱内温度失控；

3） 防止培养箱内水盘缺水，导致培养箱内湿度过低。

培养基适应

1. 直接适应：最初培养阶段，Hi Five 细胞按初始密度 0.5×10⁶ cells/mL 接种，SF9 细胞按初始密度 1.0×10⁶cells/mL 接种，直接将培养基更换为昆虫细胞无血清悬浮生长培养基 (A-EXO005) 进行培养。待细胞培养 2-3代，且生长稳定后进行后续实验。Hi Five 细胞稳定生长时按 0.5×10⁶cells/mL 密度接种，SF9 细胞稳定生长时按 1.0×10⁶cells/mL 密度接种，培养 72h 后均可达到 5-7×10⁶ cells/mL，细胞活率≥90%。

2. 间接适应：A-EXO005 培养基与细胞原培养基 1：1 混合培养细胞，连续传 2-3 代，细胞稳定生长后可将培

养基更换为 A-EXO005 培养基，再传 2-3 代，细胞生长稳定后进行后续实验。Hi Five 细胞稳定生长时按 0.5×10⁶ cells/mL 密度接种，SF9 细胞稳定生长时按 1.0×10⁶cells/mL 密度接种，培养 72h 后均可达到 5-7×10⁶cells/mL，细胞活率≥90%。

3. 注意事项：

3.1. 根据细胞具体情况选择进行培养基直接适应或者间接适应。

3.2 细胞驯化初期，若出现密度低、结团等不稳定状态，根据密度选择合适的传代方式。

a. 稀释传代：根据细胞密度计算传代时所需细胞悬液，去除多余细胞悬液并补加新鲜培养基。

b. 离心传代：根据细胞密度计算传代时所需细胞悬液，800rpm（114g）离心 5min，去除上清，用新鲜

培养基重悬细胞。

4. 细胞正常状态传代：

昆虫悬浮细胞复苏：

1. 预热培养基：取 20mL 的对应培养基置于 27℃预热，保证预热充分。

2. 将冻存管从液氮罐或-80℃冰箱中取出，迅速转移至 37℃水浴中，快速摇晃，直至完全融化。

3. 取预热好的培养基 5mL 于无菌离心管中，并将解冻后的细胞悬液移入此离心管中。800rpm 离心 5min（除去冻存液中 DMSO）。

4. 离心后弃去上清，用 15mL 预热好的培养基（保证较高细胞密度）重悬细胞，移至相应摇瓶，放于培养箱中

悬浮培养。

昆虫悬浮细胞传代：

1. Hi Five 细胞复苏初期传代：

细胞复苏后前两代，如果细胞密度＞2×10⁶ cells/mL，取部分细胞悬液离心传代，按初始密度 0.8×10⁶ cells/mL接种；如果细胞密度≤2×10⁶ cells/mL，进行全部离心换液（细胞刚复苏会有细胞碎片，属正常现象）。

2. SF9 细胞复苏初期传代：

复苏后 2-3 天取样计数，若细胞密度＜2×10⁶cells/mL 以下，细胞不做任何处理，继续培养 2-3 天（复苏后 4-6天），取样计数，若细胞密度 2-5×10⁶cells/mL，直接向摇瓶中加入新鲜培养基将细胞密度调整至 1×10⁶cells/mL左右，切忌不要离心传代，继续培养，若细胞密度＞5×10⁶cells/mL，可正常稀释传代。

3. Hi Five 活细胞初期传代：

收到细胞后，将细胞转移至摇瓶中，取样计数并查看细胞状态，如果细胞密度＞2×10⁶ cells/mL，可以稀释传代，按 0.8×10⁶ cells/mL 接种；如果细胞密度≤2×10⁶ cells/mL，建议全部离心传代。（细胞经历运输过程会有细胞碎片，属正常现象）。

4. SF9 活细胞初期传代：

收到细胞后，将细胞转移至摇瓶中，取样计数并查看细胞状态，如果细胞密度≥5×10⁶ cells/mL，可以稀释传代，按 2×10⁶ cells/mL 接种；如果细胞密度＜5×10⁶ cells/mL，继续培养 1-4 天，此期间需每 24h 取样计数查看细胞状态，当细胞密度≥5×10⁶ cells/mL，按 2×10⁶ cells/mL 接种，稀释传代，直至细胞恢复正常状态后，按1×10⁶ cells/mL 接种。（细胞经历运输过程会有细胞碎片，属正常现象）。

昆虫悬浮细胞冻存：

1. 待细胞恢复至正常状态后，扩大细胞培养体积准备冻存建库。尽量多建细胞库，保证备份充足。

2. 含血清冻存：选择处于对数生长期、活率＞90%细胞进行冻存，冻存细胞密度：15-20×10⁶ cells/mL，推荐20×10⁶ cells/mL。

无血清冻存：选择处于对数生长期、活率＞90%细胞进行冻存，冻存细胞密度：30-40×10⁶ cells/mL，推荐40×10⁶ cells/mL。

3. 准备冻存盒：向程序降温盒注入适量异丙醇，置于 4℃冰箱预冷。

4. 含血清细胞冻存液配制：冻存液=40%新鲜培养基+50%FBS（建议使用进口胎牛血清）+10%DMSO，冻存液配好后置于 4℃冰箱预冷。

无血清细胞冻存液配制：冻存液=45%新鲜培养基+45%细胞培养上清+10%DMSO，冻存液配好后置于 4℃冰箱预冷。

冻存液配制时，先加培养基再加血清或 DMSO，防止 DMSO 浓度过高导致血清有效成分变性。

5. 取细胞悬液，800rpm 离心 5min，弃去上清，用适量细胞冻存液重悬细胞，调整细胞密度至目标值。

6. 快速分装细胞液至冻存管中。

7. 将冻存管放入程序降温盒中，放于-80℃冰箱，24h 后转至液氮罐中储存。一段时间后复苏检测。

该试剂仅用于科学研究领域，不适用于临床诊断或其他用途。

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