PCR技术攻略了解一下!

           PCR，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。说起PCR的扩增原理，想必大家都知道，这里小编也不再赘述。PCR说容易也容易，说难也难，可怕的不是P不出来，而是P不出来还找不到原因，想到曾经无数个为此焦心的日夜，小编的心到现在还为之颤抖~

        PCR的时候，你是否还在费心的准备冰盒，是否还在担忧会否因为室温太高导致酶活降低甚至失效，今天小编为大家mark一家专门且只提供PCR相关试剂的供应商——Solis BioDyne，为你解开这些烦忧。Solis BioDyne运用独特的蛋白质稳定技术，确保其PCR试剂具有极高的稳定性，即便是在室温条件下放置1个月，酶活也丝毫不受影响，而且不管你做的是哪种PCR技术，Solis BioDyne都能满足你的需求。

• 终点PCR(End point PCR,PCR)

        顾名思义既是对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析，因为其在反应过程中无法监测反应进行情况，只有反应完成后通过跑胶得到结果,也称常规PCR。通常在常规PCR反应中，反应体系各成分是一次性加入并进入循环，极易发生引物错配和二聚体的形成，继而导致非特异性产物的扩增。而升级后的热启动PCR技术可以有效地解决这一问题，热启动通过各种物理化学方法控制PCR的必须成分，通常是DNA聚合酶，直到反应混合物被加热到可以阻止非特异性引导和引物聚合的温度后，再启动PCR来达到有效扩增特异性PCR产物的目的。

• 定量PCR（Quantitative PCR, Q-PCR）

        通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对其实模板的定性及定量分析。目前它主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

        荧光染料：在传统PCR反应体系中，加入过量荧光染料，该染料只与双链DNA小沟结合的染料，并不与单链DNA链结合，而且在游离状态不发出荧光，只有掺入DNA双链中才可以发光，因此，在PCR体系中，随着特异性PCR产物的指数扩增，每个循环的延伸阶段，染料掺入双链DNA中，其荧光信号强度与PCR产物的数量呈正相关。下图以SYBR Green I染料为例：.

        探针法：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。下图以TaqMan探针为例：

• 反转录PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）

        RT-PCR是一种将cDNA合成与PCR技术结合分析基因表达的快速灵敏的方法，主要用于对表达信息进行检测或定量分析。在实际应用中，RT—PCR又常常分为一步法RT-PCR和两步法RT-PCR。

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