BPS Bioscience双特异性CD19:CD3桥接化学发光ELISA试剂盒--免疫桥接分析利器

双特异性抗体（BsAbs）是具有针对不同抗原或同一抗原的不同表位的结合位点的抗体。它们由重链和轻链组成，需要适当的链匹配才能发挥功效。为了提高链匹配和不同应用的机会，已经开发了30多种不同的技术，如旋入孔、ART-Ig、BiTE（双特异性细胞接合剂）等。由于其优越的细胞毒性作用和较少的耐药性发展，它们在治疗癌症和其他疾病方面获得了关注。BsAbs可以作为免疫细胞-癌细胞的桥梁，增强免疫细胞的杀伤潜力。目前的BsAbs具有CD3、CD16或CD47作为结合结构域之一，并靶向CD19、PD-1、LAG-3、PSMA、间皮素或其他肿瘤抗原。B淋巴细胞抗原CD19（Cluster of Differentiation 19），也称为B淋巴细胞表面抗原B4和CVID3C，是一种在滤泡树突细胞和所有B系细胞中表达的跨膜蛋白，参与体液、抗原诱导和耐受反应的平衡。它在正常和肿瘤B细胞中的存在使其成为癌症治疗的一个有吸引力的靶点。Blinatumomab是一种CD19/CD3 BiTE，已被美国食品药品监督管理局批准用于难治性或复发性B细胞前体ALL（急性淋巴细胞白血病）患者，目前正在考虑用于CLL（慢性淋巴细胞白血病）治疗。靶向CD19和CD3的新BsAbs和格式的开发将继续为患有CD19+neneneba癌症类型的患者带来益处。

BPS Bioscience品牌的双特异性CD19:CD3桥接化学发光ELISA试剂盒（货号：82764）是一种ELISA，旨在分析双特异性抗体（BsAbs）桥接CD19（分化簇19）和CD3（分化簇3）的能力，以用于筛查和分析应用。该检测试剂盒可以确定抗CD19-抗CD3双特异性抗体是否同时结合两个靶标并将CD19连接到CD3。双特异性CD19:CD3桥接化学发光ELISA检测试剂盒配有足够的重组人CD19（氨基酸20-291）、含CD3的检测试剂和用于100种酶反应的检测缓冲液。该试剂盒还包括作为阳性对照的抗CD19-抗CD3双特异性抗体。

图1：双特异性CD19:CD3桥接化学发光ELISA检测试剂盒原理。

96孔板涂有CD19蛋白。涂覆后，将抗CD19-抗CD3双特异性抗体加入优化的测定缓冲液中。洗涤板以去除未结合的抗CD19-抗CD3双特异性抗体。然后将平板与含CD3的检测试剂一起孵育。最后，加入ELISA ECL底物以产生化学发光，可以使用化学发光读数器进行测量。化学发光信号与桥接效率成正比。

应用

研究CD19:CD3复合物的形成并同时评估BsAbs与其双抗原靶点的结合

用于药物发现和高通量筛选（HTS）。

注：适用于人血清、细胞培养上清液和纯化蛋白质。

供应材料：

 *蛋白质的浓度是特定批次的，将在试管上标明。

未提供但必需的材料：

测试样本（纯化的重组蛋白，人血清，细胞培养上清液）

1x PBS（磷酸盐缓冲盐水）

PBST缓冲液（含0.05% Tween-20的1x PBS）

能够读取发光信号的微孔板读取器

可调节的微量移液器和无菌吸头

旋转摇床

储存条件：

当按照指示储存材料时，本试剂盒从收到之日起至多6个月内性能最佳。

安全：

本产品仅供研究使用，不用于人体或治疗用途。本产品应被视为危险物品，吸入、与皮肤、眼睛、衣物接触以及吞食都是有害的。

如果发生接触，请彻底清洗。

禁忌：

本试剂盒与高达1%的DMSO兼容。

检测协议：

所有样本和对照应成对进行。

检测应包括“空白”、“阳性对照”和“测试样本”条件。

我们建议在使用过程中将稀释的蛋白质保持在冰上。

有关蛋白质处理的详细信息，请参阅蛋白质常见问题解答（bpsbioscience.com）。

样本收集、处理和储存的变异可能导致样本检测结果的差异。

如果使用人血清或细胞培养上清液，我们建议在样本准备和分析过程中使用LysA?蛋白酶抑制剂鸡尾酒试剂盒（#82199）。

我们建议使用抗CD19-抗CD3双特异性抗体（#101076）作为内部对照。如果不对对照双特异性抗体进行剂量反应曲线测试，我们建议将抗CD19-抗CD3双特异性抗体以0.1X、1X和10X的EC50值进行测试，该值显示在下面的验证数据中。

有关如何准备试剂稀释液的说明，请参阅连续稀释协议（https://bpsbioscience.com/serial-dilution-protocol）。

步骤1：包被96孔板

在运行样本的前一天包被板。

1. 在冰上解冻CD19。短暂离心含有蛋白质的试管以恢复其全部内容物。

2. 将CD19蛋白稀释至2 ng/?l，使用1x PBS（每孔50 ?l）。

3. 向每个孔中加入50 ?l稀释后的CD19。

4. 在4°C下过夜孵育。

5. 使用每孔200 ?l的PBST缓冲液洗板三次。

6. 将板轻敲在干净的纸巾上以去除液体。

7. 通过向每个孔中加入200 ?l的阻断缓冲液9来阻断孔。

8. 在室温（RT）下至少孵育90分钟。

9. 使用每孔200 ?l的PBST缓冲液洗板三次。

10. 将板轻敲在干净的纸巾上以去除液体。

步骤2：双特异性桥接

1. 通过将5x PP-02检测缓冲液与蒸馏水按1:5的比例稀释，准备1x检测缓冲液。

2. 准备稀释后的抗CD19-抗CD3双特异性抗体对照（对照双特异性抗体）（每孔50 ?l）。

2.1 在冰上解冻抗CD19-抗CD3双特异性抗体。短暂离心试管以恢复试管的全部内容物。

2.2 为剂量反应曲线准备从40 ng/?l开始的抗CD19-抗CD3双特异性抗体的连续稀释，使用1x检测缓冲液（每孔50 ?l）。

3. 向“阳性对照”孔中加入50 ?l稀释后的抗CD19-抗CD3双特异性抗体。

4. 使用1x检测缓冲液准备感兴趣生物样品（测试样本）的连续稀释，以达到期望的最终浓度（每孔50 ?l）。

5. 向标记为“测试样本”的孔中加入50 ?l的每个测试样本。

6. 向“空白”孔中加入50 ?l的1x检测缓冲液。

7. 在室温下轻轻摇动板子孵育1小时。

8. 使用每孔200 ?l的PBST缓冲液洗板三次，然后将板子轻敲在干净的纸巾上。

注：额外的阻断可能会提高信噪比。如有必要，通过向每个孔中加入200 ?l的阻断缓冲液9来阻断孔，持续10分钟。

9. 在冰上解冻含有CD3的检测试剂。短暂离心含有蛋白质的试管以恢复其全部内容物。

10. 用阻断缓冲液9将含有CD3的检测试剂稀释1000倍（每孔50 ?l）。

11. 向所有孔中加入50 ?l稀释后的含有CD3的检测试剂。

12. 在室温下轻轻摇动板子孵育1小时。

13. 使用每孔200 ?l的PBST缓冲液洗板三次，然后将板子轻敲在干净的纸巾上。

步骤3：检测

1. 就在使用前，将ELISA ECL底物A和ELISA ECL底物B各1体积混合（每孔100 ?l的混合液）。

2. 向每个孔中加入100 ?l的混合液。

3. 立即在能够读取化学发光的发光计或微孔板读取器中读取板子。

4. 应该从所有其他值中减去“空白”值。

读取化学发光

化学发光是由于化学反应而产生的光（发光）。检测化学发光不需要选择波长，因为使用的方法是基于发射光度测量，而不是发射光谱光度测量。

为了正确读取化学发光，请确保板读取器设置为LUMINESCENCE模式。典型的积分时间是1秒，板子移动后的延迟是100毫秒。在测量光发射时不要使用滤光片。对于Synergy 2 BioTek板读取器的典型设置是：使用滤光轮上的“孔”位置；光学位置：顶部；读取类型：终点。可以根据不含酶的对照实验的发光度调整灵敏度（通常我们将这个值设置为100）。

示例结果：

图1. 两种不同的抗CD19-抗CD3双特异性抗体同时结合其双重抗原靶标的能力。

使用双特异性CD19:CD3桥接化学发光ELISA试剂盒验证了两种针对CD19和CD3的BsAb（#101076和#100441）的桥接能力。使用Bio-Tek微孔板读取器测量发光度。结果以桥接百分比表示，其中最大结合度设置为100%。

文献参考：

Robinson H., et al., 2018 Blood 132 (5): 521-532.

Ma J., et al., 2021 Front Immunol. 12:626616.

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