ALPCO胰岛素ELISA测定程序及结果计算方案

ALPCO胰岛素ELISA用于定量测定血清和血浆中的胰岛素。

艾美捷胰岛素ELISA（ALP-80-INSHU-E01.1）检测原理：

ALPCO胰岛素ELISA是一种夹心型免疫测定法。96孔微孔板涂有胰岛素特异性单克隆抗体。将标准品、对照品和样品加入带有检测抗体的微孔板孔中。然后将微孔板在酰胺板振荡器上以700-900rpm的速度孵育。第一次孵育完成后，用洗涤缓冲液洗涤孔并吸干。加入TMB底物，在微孔板振荡器上以700-900rpm的速度第二次孵育微孔板。一旦第二次孵育完成，加入停止溶液，用分光光度计在450nm处测量光密度（OD）。产生的颜色强度与样品中胰岛素的量成正比。

胰岛素ELISA测定程序：

所有试剂和微孔板条在使用前应平衡至室温（18-25°C）。使用前轻轻混合所有试剂。每次测定运行和每次使用多个微孔板时，都必须执行标准曲线。所有标准品、对照品和样本都应双重运行。

1. 在打开铝箔袋前，应先将微孔板平衡至室温。为标准品、对照品和样本的双重测定分配足够的微孔板条。其余的微孔板条应存放在含干燥剂的密封铝箔袋中，置于2-8°C。

2. 将每个标准品、对照品和样本的25微升分别吸入相应的孔中。见试剂准备部分以获取对照品重组说明。

3. 向每个孔中加入100微升的检测抗体。

4. 用板封膜覆盖微孔板，在室温下孵育1小时，在微孔板振荡器上以700-900转每分钟的速度摇动。

5. 倒掉孔中的内容物，使用微孔板洗涤器用每次350微升的工作强度洗涤缓冲液洗板6次（见试剂准备）。或者，使用洗涤瓶（不要使用多通道移液管）将工作强度洗涤缓冲液注入孔中。每次洗涤之间，将微孔板倒置以丢弃液体，并在吸水纸上用力拍打倒置的微孔板。在最后洗涤后（自动或手动），通过倒置并用力拍打微孔板在吸水纸上，去除孔中的任何残留洗涤缓冲液和气泡。

6. 向每个孔中加入100微升的TMB底物。

7. 用板封膜覆盖微孔板，在室温下孵育15分钟，在微孔板振荡器上以700-900转每分钟的速度摇动。

8. 向每个孔中加入100微升的终止溶液，并轻轻摇动微孔板以混合内容物。在进行下一步之前，去除任何气泡。

9. 将微孔板放入能够读取450纳米吸光度的微孔板阅读器中。在加入终止溶液后应立即分析微孔板，且不得超过30分钟。

胰岛素ELISA结果计算：

从标准品中构建标准曲线。零标准应作为空白，其平均值从每个孔中减去。建议使用软件程序来计算标准曲线并确定样本的浓度。胰岛素ELISA是一种配体结合测定，其响应与分析物浓度呈现S形关系。目前被普遍接受的此类曲线的参考模型使用4或5参数逻辑（pl）拟合，因为这些模型可以在更大的范围内优化准确性和精确度。尽管三次样条和其他模型是可以接受的方法，但它们通常在范围的低端和高端显示出较低的测定内准确性和精确度。在以下示例中，使用了5参数逻辑拟合来最大化低浓度样本的准确性和精确度。然而，由于个别实验室条件的影响，所有模型在可检测范围的最低端和最高端的准确性和精确度都是有限的。因此，在解释分析物响应变得非线性时所得出的结果时，应始终谨慎。

胰岛素ELISA文献参考：

Finlay JWA, Dillard RF. Appropriate Calibration Curve Fitting in Ligand Binding Assays. AAPS Journal. 2007; 9(2): E260-E267.