Tymora应用--解析LRRK2介导氟哌啶醇间接通路纹状体投射神经元的变化

解析文章《LRRK2 mediates haloperidol-induced changes in indirect pathway striatal projection neurons》

作者：

Chuyu Chen 1,6 , Meghan Masotti 2 , Nathaniel Shepard 1,2 , Vanessa Promes 1,6 , Giulia Tombesi 1,6 , Daniel Arango 1 ,Claudia Manzoni 3 , Elisa Greggio 4 , Sabine Hilfiker 5 , Yevgenia Kozorovitskiy 2 , Loukia Parisiadou 1,6 *

链接：

https://www.bioz.com/articles/showDocs/?q=bio_rxiv__2024__06__06__597594&uq=707-48&v=PMC&k=1dS238k0216N820MIp01&ix=45ad23

一、背景

本文研究了LRRK2激酶在调节抗精神病药物氟哌啶醇（haloperidol）诱导的纹状体间接通路神经元变化中的作用。氟哌啶醇通过拮抗多巴胺D2受体（D2R）来管理多种神经精神疾病的精神症状，但其显著副作用——锥体外系症状（EPS），类似于帕金森病（PD）的运动障碍，给临床治疗带来了挑战。本文旨在通过药理或遗传手段抑制LRRK2激酶活性，探索LRRK2与氟哌啶醇在信号传导中的相互作用，并揭示其分子机制。

二、方法

1. 实验动物与药物处理

动物模型：使用了野生型（WT）小鼠、LRRK2敲除（KO）小鼠、表达LRRK2 G2019S突变基因的敲入（KI）小鼠、以及特定基因编辑的小鼠模型（如Drd2条件性敲除小鼠）。

药物处理：氟哌啶醇（1 mg/kg）单次或连续注射7-14天，同时给予LRRK2激酶抑制剂MLi-2（10 mg/kg）或PFE-360（5 mg/kg），通过口服或腹腔注射给药。

2. 行为学测试

催眠测试：通过测量小鼠在水平棒上的不动时间来评估氟哌啶醇诱导的催眠效应。

开场实验：记录小鼠在开放场地中的运动距离，评估运动能力。

加速转棒测试：评估小鼠在加速转棒上的运动学习能力。

3. 电生理学和解剖学分析

全细胞膜片钳记录：记录纹状体间接通路神经元（iSPNs）的放电活动，评估其兴奋性变化。

树突棘密度分析：使用共聚焦显微镜观察并计算iSPNs的树突棘密度。

4. 蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学分析

样品处理：使用Tymora品牌的PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit试剂盒（货号：707-96）对小鼠纹状体样品进行磷酸肽富集。

LC-MS/MS分析：通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对总蛋白和磷酸化蛋白进行定量分析。

5. 免疫荧光和原位杂交

免疫荧光：使用特异性抗体标记磷酸化S6核糖体蛋白（p-rpS6）和GFP，观察iSPNs中信号分子的变化。

单分子荧光原位杂交（smFISH）：检测即刻早期基因（IEGs）如Nr4a1和Arc的mRNA表达。

三、实验设计与结果

1. LRRK2激酶活性对氟哌啶醇诱导运动障碍的调控

行为学结果：LRRK2激酶抑制剂显著减轻了氟哌啶醇诱导的催眠效应和运动减少，表明LRRK2激酶活性在氟哌啶醇引起的运动障碍中起关键作用。

电生理学结果：LRRK2抑制恢复了氟哌啶醇处理小鼠iSPNs的兴奋性，进一步支持了LRRK2在调控氟哌啶醇效应中的作用。

2. LRRK2在氟哌啶醇诱导的分子变化中的作用

磷酸化蛋白质组学分析：发现氟哌啶醇处理导致小鼠纹状体中多种磷酸化蛋白水平发生变化，这些变化与LRRK2 G2019S突变小鼠中的磷酸化模式相似。

即刻早期基因表达：氟哌啶醇和LRRK2 G2019S突变均上调了iSPNs中Nr4a1和Arc的mRNA表达，且这些效应可被LRRK2激酶抑制剂逆转。

3. Tymora品牌的PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit试剂盒作用和价值

作用：该试剂盒在本文的实验中发挥了关键作用，通过高效富集磷酸肽，使得研究团队能够精确分析氟哌啶醇处理及LRRK2突变对小鼠纹状体磷酸化蛋白组的影响。这种深度磷酸化蛋白质组学分析为理解复杂信号通路提供了有力工具。

价值：

高灵敏度与特异性：能够检测到低丰度的磷酸化蛋白，对于揭示信号转导过程中的细微变化至关重要。

简化工作流程：试剂盒设计简化了磷酸肽富集的步骤，提高了实验效率和可重复性。

广泛应用：不仅适用于本文中的神经系统研究，还可广泛应用于癌症、代谢疾病、心血管疾病等领域的磷酸化蛋白质组学研究。

四、结论

本文揭示了LRRK2激酶在氟哌啶醇诱导的纹状体间接通路神经元变化中的核心作用。通过抑制LRRK2激酶活性，可以显著减轻氟哌啶醇的副作用，为开发新型抗精神病药物提供了新思路。此外，Tymora品牌的PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit试剂盒在本文中的应用展示了其在磷酸化蛋白质组学研究中的卓越性能和价值。这一发现不仅深化了我们对多巴胺受体信号传导机制的理解，也为帕金森病和相关精神疾病的治疗开辟了新的途径。

Tymora品牌PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

货号：707-96 富集磷酸化蛋白

PolyMAC 基于金属离子功能化的可溶性纳米聚合物，在均匀的水环境中螯合磷酸肽。与目前基于固相微米和纳米颗粒的策略相比，PolyMAC 表现出出色的重现性、卓越的选择性、快速的螯合时间以及从复杂混合物中高的磷酸肽回收率。

从这段描述中可以看出 PolyMAC 的几个显著优势：

一、出色的重现性

意味着在不同的实验条件下或者由不同的实验人员进行操作时，都能得到较为一致的结果。这对于科学研究的可靠性和可重复性至关重要，能够减少实验误差，提高研究结果的可信度。

二、卓越的选择性

可以更精准地从复杂混合物中识别并结合磷酸肽，减少其他非目标物质的干扰。在分析复杂生物样本时，高选择性能够确保对特定目标分子的准确检测和研究。

三、快速的螯合时间

能够提高实验效率，缩短研究周期。在现代科学研究中，时间往往是一个关键因素，快速的反应时间可以使研究人员更快地获得实验结果，加速研究进程。

四、高磷酸肽回收率

从复杂混合物中有效地回收磷酸肽意味着可以更充分地利用样本，提高分析的灵敏度和准确性。对于低丰度的磷酸肽，高回收率尤为重要，可以确保对这些关键生物分子的检测和研究。

综上所述，PolyMAC 这种基于可溶性纳米聚合物的技术在磷酸肽的分析和研究中具有很大的潜力，有望为相关领域的研究提供更高效、更可靠的方法。