专业级氨基甲酸酯化IP试剂盒：实验流程与技巧全面解析

氨甲酰化是一种非酶促且不可逆的蛋白质翻译后修饰，其中氰酸/异氰酸向赖氨酸侧链的ε-氨基添加一个羰基团，将赖氨酸转化为非标准氨基酸同型瓜氨酸。^1.2 氰酸主要由尿素分解形成，也可以在髓过氧化物酶的作用下，通过硫氰酸盐的氧化在炎症部位形成，例如动脉粥样硬化组织。^1-3 低密度脂蛋白(LDL)可以发生羰基化，具有动脉粥样硬化性质，破坏LDL受体结合，增加血管平滑肌细胞增殖和内皮细胞死亡。^3.4 患有导致尿素水平升高的疾病（如慢性和终末期肾脏疾病）的患者血浆中的蛋白质羰基化和羰基化LDL水平增加。此外，血浆中与蛋白质结合的同型瓜氨酸水平与主要不良心脏事件的频率和死亡率呈正相关，并可预测心血管疾病风险。³ 羰基化蛋白还可以诱导免疫反应，导致抗同型瓜氨酸自身抗体的产生，这些抗体在类风湿关节炎患者中水平较高，并与关节损伤程度呈正相关。⁵

 图1.赖氨酸氨酰化为高瓜氨酸

关于这个检测:

Cayman的氨基甲酸酯化IP试剂盒（货号：601930-1）提供了一种方便的方法，用于从细胞裂解液中捕获和浓缩羰基化蛋白，该方法是使用与琼脂糖珠偶联的抗羰基化单克隆抗体。从树脂中洗脱捕获的蛋白后，可以通过SDS-PAGE进行分离，并通过西方印迹(WB)分析，使用试剂盒中包含的抗羰基化(同型瓜氨酸)多克隆抗体或用户提供的特定目标抗体。试剂盒中提供的阳性对照样本确保了检测的适当性能:

1. 确定处理样本与未处理样本中赖氨酸羰基化的变化。

2. 证明目标蛋白在体外发生了羰基化。

3. 通过西方印迹和蛋白质组学分析鉴定和表征羰基化蛋白。

检测前准备

试剂准备:

除非另有说明，所有试剂都可以直接使用。裂解缓冲液

·检测与广泛的裂解缓冲液兼容

·避免使用会导致蛋白质变性的缓冲液成分

·尽可能减少还原剂（例如，DTT）和洗涤剂的使用

·建议的裂解缓冲液：50 mM Tris-HCl，pH 7.5，含有150 mM NaCl，0.5%（体积/体积）NP-40，以及蛋白酶抑制剂混合物。

洗脱试剂:

选择适合预期分析方法的适当洗脱试剂：

a) SDS-PAGE样品加载缓冲液，用于WB分析

b) 0.1%甲酸，用于蛋白质组学分析

样品准备:

推荐的样品/对照裂解液的体积和浓度为200μl，浓度为1-5 mg/ml，作为一个起点。如有必要，用裂解缓冲液调整裂解液浓度。建议使用500 ng羰基化牛血清白蛋白作为阳性对照。

执行检测

检测优化:

从特定裂解液样本中捕获羰基化蛋白的最佳检测条件必须由用户确定。调整以下参数可能有助于此过程：

- 样本体积：100-500μl

- 样本浓度：1-5mg/ml

- 羰基化亲和吸附剂体积：40μl悬浮液（20μl沉降树脂）

- 检测时间：最少1小时至过夜

在整个设置过程中，保持反应组分在冰上。

羰基化亲和吸附剂准备:

1. 通过轻轻倒置管子，重新悬浮羰基化亲和吸附剂（项目编号601931）。

2. 将40μl的羰基化亲和吸附剂悬浮液（20μl沉降树脂）分装到所需数量的微量离心管中。

3. 每个管子加入1ml洗涤缓冲液。

a. 使用移液器混合。

b. 以低速（500-1,000xg，两分钟）离心以收集基质。

c. 丢弃流穿液。

4. 至少重复基质洗涤/收集步骤两次。

5. 向管中加入200μl样本裂解液或500 ng羰基化牛血清白蛋白对照。

6. 在4℃下旋转混合孵育1小时。

7. 以低速（500-1,000×g，两分钟）离心以收集基质。

8. 移除流穿液并保留为“未结合部分”，以备后续分析（如需要）。

9. 将柱子放回收集管中。

10. 通过向管中加入1ml洗涤缓冲液来洗涤基质。

· 以低速（500-1,000×g，两分钟）离心以收集基质。

· 再重复洗涤步骤三次。

11. 对于SDS-PAGE/WB分析：

· 在最后一次洗涤后尽可能移除流穿液，但不要移除树脂。

· 向管中加入20μl的1X SDS-PAGE样品缓冲液并用手指轻弹混合。

· 加热至75℃，持续10分钟。

· 以低速（500-1,000×g，两分钟）离心以收集洗脱物。

12. 对于蛋白质组学分析：

· 在最后一次洗涤后尽可能移除流穿液，但不要移除树脂。

· 向树脂中加入10倍体积（200μl）的0.1%甲酸。

· 在室温下旋转混合5-10分钟。

· 以低速（500-1,000xg，两分钟）离心以收集洗脱物。

· 将洗脱液冷冻干燥并在后续处理分析前重新悬浮于胰蛋白酶消化或其他缓冲液中，或存储于-20℃。

化验结果示例:

图2.氨甲酰化IP试剂盒的蛋白质印迹分析。使用甲酰化亲和吸附剂将甲酰化和对照细胞裂解物以及提供的阳性对照物拉下，洗脱，在12%凝胶上运行，转移硝化纤维素，并用提供的抗甲酰化（高瓜氨酸）多克隆抗体进行检测。这些数据表明，亲和吸附蛋白和多克隆抗体都只识别氨基甲酰化蛋白。

文献参考：

1.Stark,G.R.,Stein,W.H.,and Moore,S.Reactions of cyanate presentin aqueous urea with amino acids and proteins.J.Biol.Chem.235(11),3177-3181(1960).

2.Long,J.,Vela Parada,X.,and Kalim,S.Protein carbamylation in chronickidney disease and dialysis.Adv.Clin.Chem.87,37-67(2018).

3.Wang,Z.,Nicholls,S.J.,Rodriquez,E.R.,et al.Protein carbamylationlinks inflammation,smoking,uremia and atherogenesis.Nat.Med.13(1),1176-1184(2007).

4.Ok,E.,Basnakian,A.G.,Apostolov,E.O.,et al.Carbamylated low-densitylipoprotein induces death of endothelial cells:A link to atherosclerosis inpatients with kidney disease.Kidney Int.68(1),173-178(2005).

5.Shi,J.,Knevel,R.,Suwannalai,P.,et al.Autoantibodies recognizingcarbamylated proteins are present in sera of patients with rheumatoidarthritis and predict joint damage.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 108(42),17372-17377(2011).

Cayman向科学工作者提供多研究领域的生化、免疫试剂和分析试剂盒，其产品被广泛应用于肿瘤、氧化氮、神经学、凋亡、氧化性损伤、内分泌学等不同研究领域.开曼公司可提供用于检测的特色试剂盒，如：类花生酸类物质、游离的生物标志、环核苷、激素及氧化氮等；也提供多种高质量试剂，包括：类花生酸类物质、氧化氮试剂及许多相关脂质、脂肪酸、酶和抗体.作为开曼公司在中国的区域总代理，艾美捷科技有限公司将为中国客户提供全面的开曼公司产品以及客户订制化服务.