II型胶原蛋白检测试剂盒，多物种的灵敏度与特异性分析

II型胶原蛋白在胶原蛋白家族中独特，其组织分布仅限于无血管组织，如软骨和眼球的玻璃体。由于II型胶原蛋白可以在实验动物中诱导关节炎，因此在某些自身免疫性疾病的发病机制中，怀疑存在对II型胶原蛋白的自身免疫反应，这些疾病包括类风湿关节炎（RA）、与RA相关的眼部疾病，以及影响特定含有II型胶原蛋白的组织的复发性多软骨炎。

II型胶原蛋白检测试剂盒（编号：6018）旨在通过ELISA定量来自人类、猴子、猪、牛、鼠类、兔子、马、狗和小鸡等不同物种的可溶性天然II型胶原蛋白，适用于细胞培养样本或组织标本。该试剂盒可选择在1步或2步程序中进行标准和检测抗体步骤（检测大纲）。Chondrex建议使用1步方案以节省时间。然而，2步检测协议与Chondrex I型胶原蛋白检测试剂盒的协议相同，两者的标准曲线和样本结果可比较。请使用最适合您研究的协议。

ELISA检测试剂盒用于定量多种物种的II型胶原蛋白。

艾美捷II型胶原蛋白检测试剂盒，多物种：

货号：6018

格式：96孔ELISA板，带可拆卸条。

检测类型：夹心ELISA。

检测时间：

1步法：3.5小时；

2步法：5.5小时。

标准范围：200 ng/ml - 3.1 ng/ml。

样本数量：每板最多可处理40个（重复）样本。

样本类型：溶解胶原蛋白和细胞培养基。

推荐样本稀释：1:1 - 1:1000。

着色剂：OPD（在490 nm读取）。

存储：-20°C，保存12个月。

验证数据：组内重复（2.1-4.4%）/组间重复（6.3-9.3%）/加标测试（86-97%）。

注释：该试剂盒可选择在1步或2步程序中进行标准和检测抗体步骤的操作。

溶解胶原蛋白：

为通过ELISA测定培养细胞层和组织中的胶原蛋白含量，需要对胶原蛋白进行溶解。对于组织标本，强烈建议使用少量胃蛋白酶进行原胶原的制备，因为其他中性蛋白酶，如胰蛋白酶和木瓜蛋白酶，会将胶原蛋白消化为小肽。胃蛋白酶只会消化胶原分子N端和C端的肽段，而无法消化胶原分子的螺旋结构区域。

通过有限的胃蛋白酶消化从组织中溶解胶原蛋白（通常胶原蛋白与胃蛋白酶的比例为100:1）取决于组织类型和分子内及分子间交联的含量。例如，骨头和跟腱对胃蛋白酶消化具有抵抗性，只有10-20%的胶原组织会被溶解。小牛皮胶原蛋白在24-48小时内可被胃蛋白酶完全溶解，而成年皮肤的溶解时间则需7-9天。对胃蛋白酶抗性不溶胶原可通过碱性处理溶解。将不溶胶原悬浮在含10% Na2SO4和0.1M胺类化合物（如Tris）的冷0.1N NaOH溶液中，并在4°C下培养1-2周。处理完后用HCl中和pH至5.0，再用0.05M醋酸或中性缓冲液（如0.1M Tris-0.3M NaCl，pH 7.5）稀释。

因此，个体样本的最佳溶解条件应在处理样本之前确定。胶原蛋白可以在非还原条件下通过6% SDS凝胶进行分析，以真实的I型胶原作为标准。如果样本中出现比γ链（分子量=300 Kd）更大的带，样本必须进一步用胃蛋白酶或弹性酶消化，这将消化分子内及分子间的胶原交联。另一方面，如果在α链（分子量=100 Kd）下观察到较小的带或拖尾带，可能是样本过度消化。因此，了解各个胶原样本的生物和物理化学特性至关重要。

计算结果：

对空白（B）、标准和测试样本的重复OD值进行平均。

从标准和测试样本的平均OD值中减去平均的空白OD值。

将标准的OD值与标准浓度（ng/ml）绘图，使用对数/对数图将数据线性化。图1显示了一个代表性实验，其中标准范围为3.1-200 ng/ml，并比较了1步和2步协议。

测试样本中胶原蛋白的ng/ml可以通过回归分析计算。将其乘以样本稀释因子，以获得原始样本标本中的胶原蛋白浓度（ng/ml）。

图1 - II型胶原蛋白检测ELISA试剂盒的典型标准曲线