3D细胞培养专题1——全新一代微载体，给细胞安个家

干细胞培养方法

当前干细胞最主要的培养方法仍是2D培养，2D培养仅在一个平面上支持干细胞生长，无法再现生物体内细胞真实的3D立体微环境。2D培养环境在生物活性、培养基结构、营养物质的释放等很多方面均远不及3D培养，使干细胞逐渐丧失其原有的性状、形态、结构和功能，导致其研究结果与体内试验结果经常不一致，精确性较低，所提供的培养环境与生物体内微环境差距甚大，必然对干细胞的增殖分化产生负面作用。同时，2D培养增殖效率低，已经无法满足临床干细胞大剂量应用的需求。正是由于2D培养局限性太多，促使国内外学者对3D培养技术和3D培养体系进行深入探索。

（A）在2D培养中生长的从上面(顶部面板)观察图像，细胞表面保持正常形态; (B)在3D培养中生长的从上面(顶部面板)观察图像，细胞表面保持正常形态; (C)在2D培养中生长的从侧面(底部面板)观察图像，细胞厚度严重收缩; (D)在3D培养中生长的从侧面(底部面板)观察图像，细胞厚度仍保持正常体内形态。

3D干细胞培养技术

体外细胞培养的一个重要原则是需模拟体内细胞生长环境，该模拟系统中最重要的核心因素是细胞与培养环境之间的相互作用。不同于传统的二维单层细胞培养，三维干细胞培养技术(three-dimensional cell culture，TDCC，简称3D培养)是指通过细胞聚集建立细胞球或将细胞嵌入支架上或支架内来模拟真实生物体组织的ECM（细胞外基质），进而在一定程度上模拟体内微环境。3D培养技术既能保留体内细胞微环境的物质及结构基础，又能展现细胞培养的直观性及条件可控性的优势。

那么，你知道目前都有哪些3D细胞培养技术吗？一起来看一下吧！3D细胞培养技术很多，但总结起来主要可分为3类：

1.3D水凝胶

水凝胶是水膨胀性的高分子网络，被设计用来模拟复杂的细胞外微环境。水凝胶由水、ECM蛋白和生长因子组成。用于三维细胞培养的第一代水凝胶是从小鼠肉瘤细胞基底膜提取的ECM聚合物。

举例：ECM凝胶

从小鼠肉瘤细胞基底膜提取的天然ECM，可以提供非常丰富的营养，与细胞的发育具有高度兼容性。ECM的主要组分是层粘连蛋白、IV型胶原、蛋白多糖硫酸乙酰肝素和巢蛋白。这种水凝胶聚合物可通过20-40°C热激活，凝胶化过程也是可逆的(蛋白质浓度:8–12mg/ml)。

在BME中培养16天后，对MCF-10A细胞进行染色：A）细胞染色试剂盒（结构）；B）细胞核；C）线粒体膜电位； BME中培养12天后，对PC-3细胞进行染色：D）Calcein AM（细胞活力）；E）CPA染料1（细胞核）；F）线粒体膜电位

2.细胞聚集

基于细胞聚集的方法不需要额外添加细胞外基质蛋白，细胞会产生内源的细胞外基质蛋白并不断聚集形成较大的聚集体。由此形成的球体大小和组分取决于起始细胞数量、孵育时间和细胞增殖率等因素。

举例：悬滴培养板

3D悬滴培养平板的孔板经过特殊设计，当在小孔上方加入一滴细胞悬液时，孔板的几何构造就会引导细胞和培养基通过一个小洞，进而形成一个稳定的悬滴。滴入口位于每个培养孔的上方，可用来更换培养基，添加外源胞外基质、生长因子、小分子，也可用来加入细胞形成混合培养物。

3.培养支架

基本原理：支架可提供一种物理支撑，细胞可以进入支架生长和行使功能。孔隙分布、暴露平面区域和孔隙度具有关键作用，其数量和分布会影响细胞渗透入支架的效率，而依据不同的制作工艺，支架具有不同的结构、随机或定制的孔隙分布。

上述三类技术可根据产品是否为细胞提供支撑材料，3D干细胞培养体系大体可分为有材料支撑培养和无材料支撑培养（通过细胞聚集形成细胞球体）两种类型。由于球体结构存在难以控制以及与天然组织的差异等缺陷，因而限制了其作为3D培养模型的应用，而3D有材料体系因为能够模拟活体组织复杂的三维立体结构而受到研究者青睐，成为当前3D干细胞主流培养体系。

3D干细胞培养材料

3D干细胞培养材料中适宜的空隙结构、表面活性、机械强度及生物相容性，使干细胞能更好地在3D材料上黏附、增殖、分化，建立材料内部各组分与干细胞间的紧密联系及动态相互作用，形成一定的3D结构。

目前，常用的培养材料有天然材料（如胶原、透明质酸、纤维蛋白、壳聚糖）、合成材料（如聚乳酸、聚己酸内酯、聚乳酸-羟基乙酸、聚乙烯对苯二甲酸酯）以及新型复合材料（包括两大类：天然材料相互复合、天然材料与合成材料复合，是如今3D干细胞培养研究的热门）。

材料的主要作用是为细胞提供原始支撑，同时也作为可溶性因子的扩散媒介，保证干细胞与材料更好黏附、迁移、增殖、分化以及细胞的长期生长。

3D干细胞培养材料需要具备的特点：

     (1) 三维多孔结构  适宜的空间结构和孔隙率，有利于干细胞的黏附、生长增殖。

     (2) 较好的生物相容性  材料对干细胞无毒性作用，可以和干细胞稳定结合，且干细胞在生物体内不会诱发排斥或炎症反应等。

     (3) 具备生物可降解性  有些材料可在生物体内自行降解，降解速率应保持在一个适宜范围内，过慢会蓄积体内影响组织生长，过快则无法起到支持干细胞生长的效应。

     (4) 良好的表面活性  有利于干细胞与材料结合，可附带更多的生长因子，对其表达和释放也具有较好的促进作用。

     (5) 良好的成型能力和合适的力学强度  良好的力学强度是其能够维持细胞生长空间的先决条件。

符合上述所有条件的全新一代的3D FloTrix™ 干细胞微载体应运而生了：

3D FloTrix™ 干细胞微载体为全球专利产品，由数万颗弹性三维多孔微载体组成， 孔隙率>90%，粒径大小可控于50-500μm区间， 均一度≤100μm，且生化、物理性质可定制，形成真正的3D仿生培养。

我们来看看实物吧：

3D FloTrix™ 干细胞微载体：

优势：

3D FloTrix™ 干细胞微载体与市面上其他常见微载体比较：

3D FloTrix™ 干细胞微载体特点及优势总结：

      1.一步法快速接种

      2.原位传代，免消化

      3.连续扩增，避免污染

      4.原位冻存微组织，保持活性及三维结构

      5.已获得一级医疗器械资质（目前唯一获批医疗器械资质的载体）

      6.药用级别原料：药典有收录，确保使用安全性（目前市面上唯一药用级别原料载体）

      7.弹性微孔结构 ：耐受剪切力，保护细胞不受损伤

      8.有效表面积大 ：9000cm2/克，约可承载108-109细胞

      9.无菌片剂包装：便于定量，无需灭菌溶胀，遇水即散

      10.可调控可定制：可为不同细胞定制适合微环境

华龛生物公司现拥有600平米的研发中心，2000平米的GMP生产平台。核心成员均由清华校友组成。3D FloTrix系列产品可提供全球领先的可实现针对干细胞大规模培养扩增工艺的整体解决方案，同时也是全球原创的针对干细胞的注射型创新药剂产品。