AAT Bioquest-2’,7’-二氯四氟乙烷双乙酸盐样品实验方案

DCFH-DA，2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（也称为2'，5'-二氯荧光素二乙酸酯），被细胞酯酶水解成2'，7'-二氢二氯荧光素（也称为2'，7'二氯荧光素），然后主要被H2O2氧化成2'。2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯可能对细胞内氧化应激期间可能增加的广泛氧化反应有反应性。该探针广泛用于监测细胞氧化还原过程。

艾美捷AAT Bioquest-2’,7’-二氯四氟乙烷双乙酸盐：

货号 15204

单位尺寸 25 毫克

分子量 487.29

溶剂 DMSO

激发（纳米）505

发射（纳米） 526

预期用途 仅用于研究（RUO）

储存 冷冻（< -15°C）；尽量减少光照暴露

激发 FITC滤光片组

发射 FITC滤光片组

推荐板 黑色壁，透明底部

仪器规格 FITC滤光片组

库存溶液的准备：

除非另有说明，所有未使用的库存溶液应在制备后分成单次使用的小份，并储存在-20°C。避免反复冻融。

2',7'-二氯二氢荧光素二醋酸酯库存溶液：

在DMSO中配制1-10 mM的工作溶液。注意：未使用的DMSO库存溶液应分装到单次使用的小瓶中，并储存在-20°C。避光保存。

工作溶液的准备：

2',7'-二氯二氢荧光素二醋酸酯工作溶液：

在生理缓冲液如PBS、HBSS、HEPES缓冲液中配制1-10 ?M的工作溶液。注意：您的应用的最佳工作浓度必须通过实验确定。

样品实验方案：

以下程序提供一般指导，并应根据您的特定应用进行修改。

从生长介质中取出细胞，将染料工作溶液加入细胞中，并在室温或37°C下孵化细胞5至60分钟。

去除染料工作溶液；用预热的HBSS冲洗，并加入预热的HBSS或生长介质，并在最佳温度下孵化。最佳恢复时间可能有很大差异，因为一些细胞类型通常表现出低水平的酯酶活性。

在将细胞暴露于实验诱导因素之前，确定加载细胞的样本的基线荧光强度。6. 阴性对照应按以下方式评估：

检查未染色细胞在绿色通道的自发荧光。

对于流式细胞术，确保细胞在染料加载和处理后前向和侧向散射不变。细胞尺寸的变化可能与处理或毒性反应导致的起泡或收缩有关。

检查有无诱导剂的染料和缓冲液/介质的无细胞混合物的荧光。在没有细胞外酯酶和其他氧化酶的情况下，随时间荧光的逐渐增加可能与自发水解、大气氧化和/或光诱导氧化有关。

检查未经处理（对照）的加载细胞的荧光，这些细胞一直在生长介质或简单缓冲液中维持。在健康细胞中，氧自由基被细胞酶和/或天然抗氧化剂清除。在染料加载恢复期之后，健康细胞应表现出在实验期间相对稳定的低水平荧光；然而，可能观察到荧光的逐渐增加（由于自氧化）或减少（由于细胞中染料的丢失或光漂白）。在没有任何刺激或诱导的情况下，健康、未经处理的细胞中荧光的突发可能表明细胞死亡的进展或其他氧化事件。

阳性对照可以用H2O2或叔丁基过氧化氢（TBHP）刺激至约100 ?M的最终浓度（根据细胞的敏感性和反应增减剂量）。

文献参考：

Mitochondrial localization of reactive oxygen species by dihydrofluorescein probes

Authors: Diaz G, Liu S, Isola R, Diana A, Falchi AM.

Journal: Histochem Cell Biol (2003): 319

Kinetic analysis of fluorescein and dihydrofluorescein effluxes in tumour cells expressing the multidrug resistance protein, MRP1

Authors: Saengkhae C, Loetchutinat C, Garnier-Suillerot A.

Journal: Biochem Pharmacol (2003): 969

Dihydrofluorescein diacetate is superior for detecting intracellular oxidants: comparison with 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, 5(and 6)-carboxy-2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, and dihydrorhodamine 123

Authors: Hempel SL, Buettner GR, O'Malley YQ, Wessels DA, Flaherty DM.

Journal: Free Radic Biol Med (1999): 146

A rapid diagnostic test for the viability of early cattle and rabbit embryos using diacetyl-fluorescin

Authors: Schilling E, Dopke HH.

Journal: Naturwissenschaften (1978): 658

Determination of fluorescin sodium in ophthalmic solutions

Authors: Robertson EJ, Patel JA.

Journal: Am J Hosp Pharm (1968): 598

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