Jackson ImmunoResearch 适用于STED的荧光团偶联抗体方案

科学家们已经研发了多种超分辨率技术，远远超出了衍射极限，能够观察到分子尺度的细节。SRM技术可以将细胞结构解析为亚细胞水平，从而获取有关细胞组分的3D结构的信息，并可以观察到单分子共定位。一起来了解一下其中一种SRM技术【受激发射耗竭（STED）显微镜】的原理：

STED对于有经验的荧光显微镜使用者来说相对简单，该方法和普通共聚焦显微镜（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用单光源，而STED使用双光源。其中一个光源发射能激发荧光团——荧光标签（研究者们以此来定位和观察蛋白）的光，另一个光源发出不同波长的光，用于抑制荧光。这束光是环形的，并且与第一束光有所重叠，因此只有环形中间区域的分子会继续发出荧光。

获得STED超分辨率图片并没有那么复杂，用户需要仔细调整参数，才能得到漂亮的结果，否则所得图片和普通confocal没有差别。

STED的原理：

显微镜透镜对光的衍射会导致来自单个点的光出现在较大的区域，这称为点扩散函数（PSF）（见图1），由于PSF的存在，使得常规显微镜无法达到超分辨。

图1：在普通光学显微镜中，成像是通过将来自点光源的光线会聚到像平面上的单个点来实现的。超出光衍射的限制，防止了射线的精确会聚，从而导致物体的图像模糊。显微镜的分辨率取决于点扩散函数（PSF）的大小，或对象在某个点的三维强度分布。在STED中，应用环形炸弹耗尽型激光器，其零点与激发激光焦点的最大值重叠。STED激光器引起荧光的“饱和耗尽”，从而“抑制了来自零点附近区域的荧光，导致有效PSF的尺寸减小”。

而受激发射耗竭（STED）显微镜通过限制样品的荧光区域（PSF）产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光，第一个按照常规显微镜激发荧光团（图2A）。第二个激光器称为耗尽激光器（STED激光器），它激发“甜甜圈”形状的激光，其中心的零强度点非常小（?30 nm）（未激发）。除了在甜甜圈的中心处之外，第二激光起到了“关闭”第一激光所产生的外圈荧光，从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处，这有效地降低了PSF，以产生非常小的单分子荧光聚焦区域，从而获得高分辨率图像（图2D）。

图2：1.单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析，从而导致图像模糊；2.STED耗尽激光器产生了淬灭外围荧光的“甜甜圈”；3.饱和耗尽在功能上降低了激励PSF；4.随之可以解析单个蛋白质

适用于STED的荧光团偶联抗体：

为了获得超分辨率，染料必须具有STED激光波长的高发射截面，并有效地实现高饱和度。这种强烈的照明确保了所有被STED激光“关闭”的分子都受受激发射的支配。合适的染料应具有低的光漂白性，具有高的量子产率和对比度，并在目标附近具有足够的标记密度。

艾美捷Jackson ImmunoResearch提供荧光染料标记的二抗，下列染料标记的二抗已被验证在STED中成功使用：

染料 货号

AlexaFluor?488——115-545-003

FITC——715-095-150

AlexaFluor?594/647 ——715-585-151

每种SRM技术都有各自的探针选择要求，Jackson ImmunoResearch提供多种已知在SRM应用中表现良好的荧光标记二抗。应该注意的是，SRM领域变化迅速，因此，建议从专业技术文献中寻求信息，以帮助选择合适的荧光团。