ALPCO瘦素ELISA试剂盒测定程序及计算方案

发布者：艾美捷科技发布时间：2024-08-30

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该检测利用了两种高度特异性的单克隆抗体：将瘦素特异性的单克隆抗体固定在微孔板上，将瘦素不同表位特异性的双克隆抗体与生物素结合。

在第一步中，样品和标准品中存在的瘦素与固定抗体和生物素化抗体结合，从而形成三明治复合物。通过洗涤步骤去除过量和未结合的生物素化抗体。

第二步，加入链霉抗生物素蛋白-HRP，它能特异性结合任何结合的生物素化抗体。同样，未结合的链霉抗生物素蛋白-HRP通过洗涤步骤去除。

接下来，加入酶底物（TMB），形成与瘦素含量成正比的蓝色产物。通过加入终止溶液使酶反应停止，将蓝色转化为黄色。在450nm处用微量滴定板读数器测量吸光度。使用一组标准来绘制标准曲线，从中可以直接读取样品和对照中的瘦素含量。

瘦素ELISA试剂盒用于酶免疫测定法定量测定人血清中的瘦素。此试剂盒仅供研究使用。不用于诊断程序。

艾美捷瘦素ELISA试剂盒（ALP-11-LEPHU-E01）测定程序：

所有试剂在使用前必须达到室温。校准品、质控品和样本应进行双重测定。一旦开始程序，所有步骤都应在无中断的情况下完成。

1. 所有试剂盒组分达到室温后，轻轻倒置混合。

2. 准备生物素-过氧化物酶结合物和洗涤缓冲液的1X工作溶液。

3. 计划微孔板孔的使用，用于校准品、质控品和样本。参见推荐的测定布局。取出将不使用的条带，并将它们放回带有干燥剂的袋子里。重新密封未使用条带的袋子并放回冰箱。

4. 将每个校准品、质控品和血清样本的20微升分别双重加入相应的孔中。

5. 将80微升的单克隆抗瘦素-生物素结合物加入每个孔中。推荐使用多通道移液管。

6. 在直径3毫米的微孔板振荡器上（大约600转/分钟）在室温下孵育1小时。

7. 使用自动微孔板洗涤器（首选）或按以下描述手动洗涤微孔板孔。自动：使用自动微孔板洗涤器，使用1X工作洗涤缓冲液进行3周期洗涤（每个孔300微升×3）。一个周期包括吸干所有孔，然后用1X工作洗涤缓冲液填充每个孔300微升。在最后洗涤周期后，吸干所有孔，然后将微孔板牢固地敲击在吸水纸上以去除任何残留液体。手动：对于手动洗涤，使用1X工作洗涤缓冲液进行3周期洗涤（每个孔300微升×3）。一个周期包括通过迅速将孔中的内容物倒入废物容器来吸干所有孔，然后使用多通道移液管将300微升的1X工作洗涤缓冲液加入每个孔中。在最后洗涤周期后，通过迅速将孔中的内容物倒入废物容器来吸干所有孔，然后将微孔板牢固地敲击在吸水纸上以去除任何残留液体。

8. 将100微升的1X工作生物素-过氧化物酶结合物加入每个孔中。推荐使用多通道移液管。

9. 在直径3毫米的微孔板振荡器上（大约600转/分钟）在室温下孵育30分钟。

10. 按照步骤7的方式再次洗涤微孔板孔。

11. 在定时间隔将100微升的TMB底物加入每个孔中。推荐使用多通道移液管。

12. 在直径3毫米的微孔板振荡器上（大约600转/分钟）在室温下孵育10-15分钟。

13. 按照步骤11的相同定时间隔将50微升的终止溶液加入每个孔中。推荐使用多通道移液管。轻轻敲击微孔板框架以混合孔中的内容物。

14. 在加入终止溶液后20分钟内，使用设置为450纳米的吸光度微孔板阅读器测量微孔板孔中的光密度（吸光度）。

计算：

1. 计算每个校准品、质控品和样本双重测定的平均光密度。

2. 使用免疫分析软件进行4或5参数曲线拟合以生成校准曲线。

3. 免疫分析软件将使用平均光密度值和校准曲线计算质控品和样本的浓度。

4. 如果样本读数超过100 ng/mL，则用测定缓冲液稀释，稀释度不超过1:8。所得结果必须乘以稀释因子。