高灵敏度皮质醇ELISA(唾液)检测原理及测定程序方案

用于通过酶免疫测定法定量测定人唾液中的皮质醇。仅供研究使用。不用于诊断程序。

艾美捷皮质醇ELISA(唾液)（11-CORHU-E01-SLV）检测原理：

皮质醇唾液ELISA是一种竞争性免疫测定。标准品、对照品和样品中存在的皮质醇与酶标记的抗原（HRP结合物）在微孔板上的有限数量的抗皮质醇抗体结合位点之间发生竞争。经过洗涤步骤去除未结合的物质后，添加TMB（酶）底物，并与HRP反应形成与存在的皮质醇量成反比的蓝色产物。孵育后，通过添加终止液终止酶反应，颜色由蓝变黄。在450nm处的微孔板读取器上测量吸光度。使用一组校准品绘制校准曲线，从而可以直接读取样品和对照品中的皮质醇量。

样品收集和储存：

避免在吃正餐后1小时内或在饮酒后12小时内收集样本。酸性或高糖食物可能会通过降低样品pH值和影响细菌生长来影响测定性能。为了尽量减少这些因素，在收集样本前10分钟彻底漱口。不要使用血液污染的样本。

每份重复测定需要大约1毫升唾液。在收集样本前10分钟彻底漱口。在不用力或诱导的情况下，将4-5毫升唾液收集到一个干净的玻璃管中（可以使用Sarstedt的Salivette）。唾液样本可以在2-8°C下储存长达24小时，或者在分析将在以后进行的情况下，储存在-10°C或更低的温度下。处理时，将所有人类样本视为可能的生物危害物质，并采取适当的预防措施。

皮质醇ELISA(唾液)样品预处理和储存：

收集后，必须按照以下程序对样本进行预处理：

1. 将样本冷冻至少2小时。

2. 解冻样本。

3. 使用漩涡混合器混合并离心样本10分钟，速度为2000x g。

4. 小心地移除上清液，并转移到一个新的标记管中。上清液将在测试的测定程序中使用。

校准品和试剂盒对照品不需要预处理；它们是以即用格式提供的。

将预处理后的唾液样本储存在2-8°C下长达24小时，或者如果分析将在以后进行，则冷冻在-10°C或更低的温度下。储存的样本在使用前应检查以确保不含沉淀物。如果有沉淀物，按照样本预处理部分的步骤3-4进行操作。处理时，将所有人类样本视为可能的生物危害物质。

质量控制：

在评估测试结果的有效性时，应评估以下标准：

1. 最高浓度的校准品达到QC证书中所述的%结合可接受范围。%结合 = （校准品的OD/校准品A的OD）x 100。

2. 试剂盒对照品获得的值在QC证书中所述的可接受范围内。

3. 使用的任何外部对照品的结果符合可接受的范围。

皮质醇ELISA(唾液)测定程序：

注意：所有将要测试的样品在使用前必须经过预处理。（参见“样品预处理和储存”部分）。校准品和试剂盒对照品不需要预处理，因为它们是即用型的。

所有试剂和样品在使用前必须达到室温，并轻轻倒置混合。校准品、对照品和样品应以双份进行测定。一旦开始程序，所有步骤都应不间断地完成。

1. 准备1X工作溶液的HRP结合物和洗涤缓冲液。

2. 从微孔板框架中取出将要使用的微孔条数量，并将其放回带有干燥剂的袋子中。重新密封袋子，并将任何未使用的条放回冰箱。

3. 将每个校准品、对照品和样品的50 ?L分别准确移液到预先确定的孔中，并进行双份测定。

4. 向每个孔中加入100 μL的1X工作HRP结合物溶液。（建议使用多通道移液器。）

5. 在室温下，使用微孔板振荡器（轨道振荡器（直径3mm）设置为600转/分钟或往复振荡器（行程长度1.5”）设置为每分钟180次振荡）孵育45分钟。

6. 使用自动微孔板洗涤器（首选）或按以下说明手动洗涤微孔板：

自动：使用自动微孔板洗涤器，进行3周期洗涤，每个孔使用300 μL的1X工作洗涤缓冲液（3 x 300 μL）。一个周期包括抽吸所有孔，然后用300 μL的1X工作洗涤缓冲液填充所有孔。在最后一次洗涤周期后，抽吸所有孔，然后用力将微孔板拍在吸水纸上以去除残留液体。

手动：手动洗涤时，进行3周期洗涤，每个孔使用300 μL的1X工作洗涤缓冲液（3 x 300 μL）。一个周期包括通过将孔的内容迅速排空到废液容器中来抽吸所有孔，然后使用多通道移液器向每个孔中移液300 μL的1X工作洗涤缓冲液。在最后一次洗涤周期后，通过将内容迅速排空到废液容器中来抽吸所有孔，然后用力将微孔板拍在吸水纸上以去除残留液体。

7. 向每个孔中加入150 μL的TMB底物（建议使用多通道移液器）。

8. 在室温下，使用微孔板振荡器（轨道振荡器（直径3mm）设置为600转/分钟或往复振荡器（行程长度1.5”）设置为每分钟180次振荡）孵育15-20分钟。

9. 向每个孔中加入50 μL的终止液（建议使用多通道移液器），按照添加TMB底物时相同的顺序和速度。轻轻拍打微孔板框架以混合孔中的内容。

10. 在添加终止液后20分钟内，使用设定为450 nm的吸光度微孔板读取器测量光密度（吸光度）。

典型表格数据：

仅样本数据。不用于计算结果。