关于IF实验产生背景的原因及降低背景的常用方法:
IF降低背景:
高背景是免疫荧光常见的问题,解决此问题可以用二抗来源的正常血清代替 BSA 做封闭液,降低抗体浓度,增加洗涤次数,洗涤至少三次,每次五分钟,推荐洗涤液为 PBS+0.05% Tween。
我们实验室之前大多数都是使用BSA进行封闭,用正常血清代替BSA进行封闭倒是第一次听说,血清真的有如此奇效,迫不及待的赶紧去尝试了一番,荧光背景确实显著降低了。
血清作为封闭剂的原理:
强烈建议在PBS中稀释至5%(v / v)的正常血清作为封闭剂,以减少免疫反应中非特异性,保守序列和/或Fc受体结合的背景。用稀释的正常血清与标记抗体来自同一宿主,可获得最佳结果,作为添加一级抗体之前的单独孵育步骤。
用血清进行封闭效果好吗?
封闭血清适用于免疫组化或者免疫荧光实验中样本的封闭,可以封闭待检样本中与蛋白质非特异性结合的位点,另外还可以封闭样品中内源性的Fc片段结合位点,阻断抗体与样品中的Fc受体结合,从而降低背景,减少假阳性。对于适用多抗的实验,选择二抗种属来源的正常血清是封闭处理的金标准。
封闭血清如何使用?
推荐用PBS将封闭血清原液稀释5-20倍,配成5%-20%的工作液,直接滴加在组织切片或者细胞涂片上,37℃度孵育10-30min(或者室温1h),清除血清,不用洗涤,滴加适当比例稀释的一抗工作液,37℃孵育1-2h或4℃过夜。
艾美Jackson ImmunoResearch 封闭血清推荐:
产品名称 货号 规格
Normal Donkey Serum(驴) 017-000-121 10 ml
Normal Alpaca Serum(羊驼) 028-000-121 10 ml
Normal Bovine Serum(牛) 001-000-121 10 ml
Normal Cat Serum(猫) 002-000-120 5 ml
Normal Chicken Serum(鸡) 003-000-120 5 ml
Normal Dog Serum(狗) 004-000-120 5 ml
Normal Goat Serum(山羊) 005-000-121 10 ml
Normal Syrian Hamster Serum(叙利亚仓鼠) 007-000-120 5 ml
Normal Horse Serum(马) 008-000-121 10 ml
Normal Human Serum(人) 009-000-121 10 ml
Normal Mouse Serum(小鼠) 015-000-120 5 ml
Normal Rabbit Serum(兔) 011-000-120 5 ml
Normal Rat Serum(大鼠) 012-000-120 5 ml
Normal Sheep Serum(绵羊) 013-000-121 10 ml
Normal Swine Serum(猪) 014-000-121 10 ml
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