Tymora应用--解析：《衰老小鼠脑中蛋白质组学和磷蛋白质组学分析鉴定的神经退行性疾病的分子特征》

解析文章：《Molecular signatures of neurodegenerative diseases identified by proteomic and phosphoproteomic analyses in aging mouse brain》

作者：Rodrigo Mohallem, Allison Schaser, Uma K. Aryal

链接：https://www.bioz.com/articles/showDocs/?q=pm39069073&uq=*&v=39069073&k=1dS238k0216N820MIp01&ix=45ad23

背景

老龄化是多种疾病的主要风险因素，包括癌症和神经退行性疾病。神经退行性疾病（如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD））的一个核心特征是大脑中蛋白质的错误折叠和异常磷酸化导致的不可逆积累。理解蛋白质磷酸化及其在老年背景下病理性蛋白聚集中的作用机制，对于开发预防或逆转这些疾病的治疗策略至关重要。

尽管先前的研究主要集中在基因表达调控上，但基因表达分析不能完全解释蛋白质的变化。蛋白质组学研究表明，只有约27%的蛋白质丰度变化可以通过mRNA丰度来解释，而翻译和蛋白质降解过程解释了约40%的蛋白质变化。因此，蛋白质组学研究可以确认基因表达研究的结果，并发现与基因表达变化无关的衰老分子标志。

此外，磷酸化等翻译后修饰（PTM）在衰老过程中起着重要作用，而这些信息无法通过基因表达分析获得。蛋白质磷酸化影响细胞生长、增殖、分化和凋亡等关键调控途径，这些途径在衰老和年龄相关疾病中至关重要。神经退行性疾病的一个共同特征是疾病特异性蛋白质（如tau和α-突触核蛋白）的不可逆聚集，这通常与蛋白质的异常磷酸化有关。

方法

本研究采用多蛋白酶消化和定量质谱技术，对年轻成年（3-4个月）、中年（10个月）和老年（19-21个月）小鼠的大脑蛋白质组和磷酸蛋白质组进行了比较和分析。

实验设计

动物与样本收集：使用A53T SynGFP小鼠品系，分别收集年轻成年、中年和老年雄性小鼠的大脑样本。所有动物实验均经普渡大学动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。

蛋白质提取与消化：将整个大脑组织切碎并用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的缓冲液匀浆。然后，使用四种不同的蛋白酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶、内肽酶Asp-N和Glu-C）对蛋白质进行消化，以提高蛋白质组和磷酸蛋白质组的覆盖率。

磷酸肽富集：使用Tymora Analytical品牌的PolyMac spin tips试剂盒对低丰度磷酸肽进行亲和纯化。该试剂盒基于金属离子功能化的可溶性纳米聚合物螯合磷酸肽，从而提高了磷酸肽的富集效率。

LC-MS/MS分析：使用Dionex UltiMate 3000 RSLC系统和Orbitrap Fusion Lumos Tribrid质谱仪进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。数据通过MaxQuant平台进行搜索和分析，使用Perseus平台进行统计分析。

数据验证：通过多反应监测（MRM）分析和Western blotting对差异表达的蛋白质进行验证。

实验

在实验过程中，Tymora Analytical品牌的PolyMac spin tips试剂盒发挥了关键作用。该试剂盒利用金属离子功能化的可溶性纳米聚合物特异性地螯合磷酸肽，从而有效地从复杂样本中富集低丰度的磷酸肽。这一步骤对于后续的质谱分析至关重要，因为它显著提高了磷酸肽的检测灵敏度和可靠性。

PolyMac spin tips试剂盒的使用带来了以下优势：

高选择性和特异性：通过金属离子与磷酸基团的特异性相互作用，试剂盒能够高效地富集磷酸肽，同时减少非磷酸肽的干扰。

操作简便：试剂盒采用自旋柱设计，简化了磷酸肽的富集流程，提高了实验效率。

高灵敏度：由于富集效率高，试剂盒使得低丰度磷酸肽的检测成为可能，从而增加了蛋白质磷酸化分析的深度和广度。

可靠性：通过严格的质量控制和质量保证流程，试剂盒确保了磷酸肽富集的稳定性和可重复性。

在本研究中，使用PolyMac spin tips试剂盒富集的磷酸肽经LC-MS/MS分析后，共鉴定出10474个一类磷酸化位点（概率>0.75）。这些磷酸化位点涉及多种与衰老和神经退行性疾病相关的蛋白质和信号通路，为后续的数据分析和生物学解释提供了丰富的信息资源。

结论

本研究通过多蛋白酶消化和定量质谱技术，系统地分析了不同年龄段小鼠大脑蛋白质组和磷酸蛋白质组的变化。主要发现包括：

蛋白质组和磷酸蛋白质组的显著变化：随着小鼠年龄的增长，多种与衰老、神经退行性疾病、炎症、细胞周期调控和细胞因子信号传导相关的蛋白质在丰度和磷酸化水平上发生了显著变化。

神经退行性疾病相关蛋白质的异常磷酸化：在老年小鼠大脑中，多种与阿尔茨海默病和帕金森病相关的蛋白质（如tau、Nefh和Dpysl2）发生了异常磷酸化，表明这些蛋白质可能更容易形成病理性聚集体。

激酶活性的变化：多种激酶的丰度和磷酸化水平在老年小鼠大脑中显著增加，这些激酶在蛋白质磷酸化过程中起着关键作用。特别是Cdk5和Gsk3b等激酶，它们通过磷酸化tau和Dpysl2等蛋白质，可能在神经退行性疾病的发病机制中发挥重要作用。

PI3K-AKT-mTOR信号通路的上调：研究还发现，老年小鼠大脑中PI3K-AKT-mTOR信号通路显著上调，这可能与细胞的衰老和增殖调控有关。

综上所述，本研究揭示了衰老对小鼠大脑蛋白质组和磷酸蛋白质组的影响，特别是与神经退行性疾病相关的蛋白质和信号通路的变化。这些发现为理解衰老和神经退行性疾病的分子机制提供了新的线索，并可能为未来的治疗策略提供新的靶点。同时，Tymora Analytical品牌的PolyMac spin tips试剂盒在磷酸肽富集中的高效表现也展示了其在蛋白质磷酸化研究中的重要价值。

Tymora品牌 PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

货号：707-96 富集磷酸化蛋白

PolyMAC 基于金属离子功能化的可溶性纳米聚合物，在均匀的水环境中螯合磷酸肽。与目前基于固相微米和纳米颗粒的策略相比，PolyMAC 表现出出色的重现性、卓越的选择性、快速的螯合时间以及从复杂混合物中高的磷酸肽回收率。

从这段描述中可以看出 PolyMAC 的几个显著优势：

**一、出色的重现性**

意味着在不同的实验条件下或者由不同的实验人员进行操作时，都能得到较为一致的结果。这对于科学研究的可靠性和可重复性至关重要，能够减少实验误差，提高研究结果的可信度。

**二、卓越的选择性**

可以更精准地从复杂混合物中识别并结合磷酸肽，减少其他非目标物质的干扰。在分析复杂生物样本时，高选择性能够确保对特定目标分子的准确检测和研究。

**三、快速的螯合时间**

能够提高实验效率，缩短研究周期。在现代科学研究中，时间往往是一个关键因素，快速的反应时间可以使研究人员更快地获得实验结果，加速研究进程。

**四、高磷酸肽回收率**

从复杂混合物中有效地回收磷酸肽意味着可以更充分地利用样本，提高分析的灵敏度和准确性。对于低丰度的磷酸肽，高回收率尤为重要，可以确保对这些关键生物分子的检测和研究。

综上所述，PolyMAC 这种基于可溶性纳米聚合物的技术在磷酸肽的分析和研究中具有很大的潜力，有望为相关领域的研究提供更高效、更可靠的方法。