ABMgood：永生化细胞

您可能听说过这样的说法：“所有美好的事物终将结束”——尤其是在珍贵的原代细胞培养物在几次传代后达到衰老状态时。然而，得益于永生化细胞系的开发，这种情况已不再如此！在本文中，我们将介绍：

一．什么是永生化细胞？

您可能习惯于使用直接从活体组织中提取的细胞，称为原代细胞。原代细胞的难点在于，每次细胞分裂后，它们的端粒都会缩短，导致细胞进入衰老状态并停止分裂，仅经过几个细胞周期。这意味着如果您正在进行长期项目，您将经常需要不断收获和重新建立新的原代细胞批次。此外，由于不同的收获条件，每个细胞批次都是不同的，这使得可重复性成为一个问题！ 

永生化细胞（也称为连续细胞或细胞系）是端粒和/或肿瘤抑制基因已经被改变的原代细胞。肿瘤抑制基因（例如p53和Rb）对于在DNA损伤的可能性更高时（即在多个细胞周期后，更多关于细胞周期的信息请访问我们的知识库）向细胞发出停止分裂的信号非常重要。在永生化细胞的情况下，这些基因已经被抑制或其功能被抑制，使细胞能够无限期地继续分裂。

图1 -端粒是DNA的重复区域，形成染色体末端的保护“帽”，保护染色体免受退化。经过每一轮细胞周期，这些端粒会变短，Z终导致细胞进入衰老阶段，细胞停止分裂。  

理想的永生化细胞具有与其亲本组织相似的基因型和表型。一些实验室使用相同的永生化细胞数十年，因此，它们的细胞系已经被很好地表征，并为其长期项目提供了一致的基线。Z古老和Z常用的人类细胞系是HeLa细胞系，该细胞系是在20世纪50年代从宫颈癌细胞中建立的！但是，正如您将在本文的质量控制部分看到的，检查细胞系的身份以确保您的细胞系是您认为的那样是非常重要的。

二．细胞永生化策略

那么，您如何工程化一个永生化细胞系呢？有两种主要方法：

方法A：端粒酶逆转录酶蛋白（TERT）表达

TERT蛋白是端粒酶的催化亚基，在大多数体细胞中通常不活跃。在这种方法中，您可以将编码人类端粒酶逆转录酶（hTERT）蛋白的cDNA插入到您感兴趣的原代细胞中。当hTERT被外源性表达时，细胞能够维持足够的端粒长度以避免衰老。这是最近开发用于细胞永生化的方法。

方法B：病毒致癌基因

病毒致癌基因，如SV40病毒的大T抗原或HPV的E6/E7致癌基因，可以通过抑制肿瘤抑制基因（例如p53和Rb）来实现永生化。这种方法比方法A更快地生效，但可能会改变一些细胞的特性。

在许多情况下，单独使用方法A和B可能不足以成功实现永生化。最近的研究发现，共同表达hTERT和病毒致癌基因具有更高的成功率，并产生更真实和正常的细胞模型，具有明确定义的遗传背景。

图2展示了正常细胞的典型寿命（绿色箭头）。每次分裂，端粒缩短，直到最终达到所谓的衰老状态，此时细胞停止复制并死亡。通过过度表达或抑制特定基因（例如破坏p53和RB途径），我们可以逆转或抑制端粒缩短，使细胞继续分裂而不达到衰老。

表1：本表展示了常见的永生化方法。每种机制都涉及破坏图2中显示的复制过程中的关键基因。右列描述了abm的永生化试剂系列中可用的形式。您可以在我们的知识库上阅读有关不同病毒的更多信息。 

三．永生化工作流程概述

图3：基本的细胞系永生化工作流程。

细胞系质量控制考虑

太好了！在这个阶段，您已经生成了一个永生化细胞系。但是，在您开始在项目中使用您的细胞系之前，有一些重要的质量控制检查您可以进行，以确保您的细胞系处于完美状态。

A.您的细胞系表征

每次永生化后，您应该始终检查您的细胞是否具有适当的标记，以及细胞的功能，以确保它代表您所使用的原代细胞。当您研究细胞途径时，这一步尤为重要，因为您不希望永生化步骤改变了特定途径、功能或细胞的表型。 例如，如果您计划使用您的细胞进行细胞毒性测定，那么使用您的永生化细胞与原代细胞一起进行细胞毒性测定是个好主意，以确保您新永生化的细胞对刺激的反应与它们的原始细胞相似。

B.传代和转基因表达测试

将您的细胞传代至少30次，以证明转基因已稳定表达，并观察它们的生长速度已提高，密度能力已增加。

C.STR分析

正如本文开头提到的，验证您的细胞系身份至关重要，因为可能会发生交叉污染或种群混合的问题。例如，根据《科学》杂志上发表的一篇论文，广泛用于实验室的著名HeLa细胞被发现污染了许多细胞系，包括Hep-2和INT407细胞系。 

识别细胞系的黄金标准是短串联重复（STR）分析。STR分析是一种方法，其中在特定位点的短串联DNA重复与标准参考配置文件进行比较。细胞系的STR分析可以用来确认其身份，定期进行STR分析是个好主意，以确保您的细胞系没有随着时间的推移受到污染。 

为了应对细胞系误识别事件，资助机构如NIH现在要求在资助申请中使用的细胞系进行STR分析，许多期刊也开始鼓励这个关键的质量控制检查。

D.支原体和病原体检测

最后，始终测试微生物污染物，如真菌、细菌和支原体是个好主意。特别是支原体，是细胞培养实验室中Z常见的污染物之一。通常很难通过显微镜下的视觉检查来检测支原体。然而，这种细菌可以影响细胞的增殖，改变其基因表达谱，并可能扭曲您的实验结果。有许多试剂盒可用，例如abm的PCR支原体检测和清除试剂盒，可以轻松检测并清除50多种类型的支原体。   

我们希望本文能帮助您获得开始您的第一个细胞永生化项目所需的信心！如果永生化过程听起来太麻烦了，不用担心——有许多细胞系库可用，包括abm的500+永生化细胞系和800+独特的细胞系，用于药物发现，全球可用。您可以在这里查看我们的目录或索取免费的实体副本。没有看到您正在寻找的特定细胞系，请查看下方表格（部分产品），或者请随时与abm中国区代理，艾美捷科技联系！400-6800-868，www.amyjet.com

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