TheWell Bioscience：VitroGel 水凝胶系统上培养OP9的3D细胞培养

【介绍】 

间充质干细胞是一种成人多能干细胞，可分化为骨、软骨、脂肪和结缔组织。在过去的二十年中，由于其广泛的可塑性、免疫调节和抗炎特性，以及相对容易从脂肪组织、骨髓、脐带血和滑液中以患者特异性的方式分离出来，它们已成为再生医学中胚胎干细胞的一种广受欢迎的潜在替代品。在体外，它们已被反复证明能够生成各种非中胚层和非间充质组织，包括肝细胞、心肌细胞、胰腺细胞、神经元细胞和黑素细胞。它们的免疫调节能力使它们受欢迎，不仅因为它们为治疗以前难以治疗的疾病（如移植物抗宿主病和器官移植）带来了希望，而且因为与诱导多能干细胞（iPSC）和胚胎干细胞（ESC）衍生的组织相比，任何来自间充质干细胞的组织本身几乎不会引起免疫反应。 然而，尽管它们具有治疗潜力，但有一个主要的挫折：在体外，它们的增殖速率往往会急剧减慢，并且容易衰老，这使得它们难以扩增到足够的治疗用量。一些研究表明，调整培养基中的葡萄糖浓度可以减轻一些衰老，但这意味着在与临床无关的环境中培养细胞，这最终可能会改变它们的遗传稳定性。已经对2D细胞培养对表达模式的影响进行了研究，发现2D培养往往会导致细胞骨架和细胞核的整体扁平化，进而导致基因和基因表达的改变以及细胞外基质的重排。三维培养已被证明在维持细胞外基质微环境方面更为成功，并能产生更均匀、可重复的结果，在包括移植在内的临床应用中也取得了更多的成功。 OP9细胞是一种特征明确的小鼠骨髓基质细胞系，由于编码巨噬细胞集落刺激因子（M - CSF）的基因发生骨硬化突变，该细胞系不产生功能性M - CSF。OP9细胞最初用于与小鼠胚胎干细胞共培养，以诱导其分化为血细胞，但它们已被表征为间充质干细胞。在这里，我们讨论了在VitroGel 水凝胶系统上培养OP9的3D细胞培养，包括VitroGel 3D - RGD和新的VitroGel RGD - PLUS，它们含有不同水平的整合素结合配体修饰（RGD肽），用于不同的细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用。（VitroGel 3D - RGD是一种即用型可调水凝胶系统，用RGD细胞粘附肽修饰，促进3D细胞培养期间的细胞附着和细胞 - 基质相互作用。VitroGel RGD - PLUS与常规VitroGel 3D - RGD相比，用3倍更高浓度的RGD肽修饰，即使在水凝胶稀释后也能保持高水平的整合素结合活性，支持需要强细胞 - 细胞和细胞 - 基质相互作用的细胞。） 材料和方法 细胞培养 OP9细胞在添加了10％FBS和1x pen - strep的α - z低必需培养基中维持培养。当培养物达到80 - 90％汇合时进行传代。对于2D水凝胶涂层培养和3D细胞培养，根据用户手册，使用VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS，如下所述。 2D涂层培养方法 用VitroGel稀释溶液（类型1）以1:0、1:1和1:3的稀释度制备2D涂层水凝胶，然后与无细胞的OP9培养基以4:1的比例混合；向每个24孔板中加入300μl。水凝胶在室温下稳定20分钟，然后将细胞添加到悬浮在300μl覆盖培养基中的水凝胶顶部。每隔一天更换培养基。 3D涂层培养方法 根据制造商的方案，用VitroGel稀释溶液（类型1）以1:3的稀释度制备水凝胶。对于共聚焦/荧光成像，使用底部有盖玻片的8孔室培养细胞，每孔使用200μl水凝胶。每隔一天更换培养基。 免疫荧光（IF）成像 由于细胞具有GFP报告基因，我们进行了活细胞成像。使用具有z堆栈功能的Leica TCS SP8扫描共聚焦显微镜在10X和20X放大倍数下拍摄图像，并通过LAS X软件和ImageJ进行处理。使用LAS X软件和ImageJ进行图像的处理和分析。

【结果】

在2D VitroGel培养中，OP9细胞表现出细胞聚集和健康的细胞形态。 我们在原始的VitroGel 3D - RGD和新的VitroGel RGD - PLUS中评估了2D培养中的OP9细胞。在组织培养板表面的标准2D培养中，OP9细胞与许多间充质细胞类型一样，采用成纤维细胞样形状，并且无法聚集（图1A）。在这种环境中，间充质干细胞增殖不佳，可能导致衰老。此外，它们在细胞培养中表现出与凋亡阶段通常相关的特征性亮点。为了了解在我们的可调系统中OP9培养的z佳条件，我们在VitroGel的各种稀释液中培养这些细胞。在VitroGel 3D - RGD中（图1B - D），仅在细胞培养2天后，细胞在所有稀释度下都形成聚集。对于更新的VitroGel RGD - PLUS（图1E - G），细胞更加健壮，在z低稀释度下形成大的集落并表现出健康的MSC形态。

图1：OP9 - GFP细胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS的2D水凝胶涂层表面上生长。与标准2D培养（A）相比，OP9细胞在仅培养2天后在3D VitroGel环境中（B - G）附着和聚集得更好。在两种VitroGel产品中，细胞在1:0稀释度下显示聚集（B，E），但在较低的凝胶强度物质下，细胞在VitroGel RGD - PLUS上扩散和附着得更好。

图2：OP9 - GFP细胞在VitroGel 3D - RGD和VitroGel RGD - PLUS中的三维培养。虽然VitroGel 3D - RGD促进细胞扩增（E，G），但新的VitroGel RGD - PLUS对OP9细胞增殖和细胞 - 细胞通信有更好的支持。

更强的细胞 - 基质相互作用帮助细胞形成细胞网络结构（F，H）。（图像A，B，C，D，G，H在20X；图像E＆F在10X）。 E的3D视图 G的3D视图 F的3D视图 H的3D视图 在VitroGel RGD - PLUS中培养OP9细胞促进细胞间网络的构建 这种特征在二维培养中通常是不可能的，并且在三维培养中可能会有所不同。为了了解我们的水凝胶系统是否能够促进这一点，我们在三维培养中用我们的两种水凝胶培养OP9细胞。根据我们之前的经验，对于3D细胞培养，OP9细胞更喜欢在软的水凝胶基质（G’ < 300 Pa）中生长。因此，本研究选择了1:3稀释的稀释VitroGel水凝胶。体内3D微环境的一个主要因素是细胞形成细胞间网络的能力。在VitroGel 3D - RGD中，培养7天后，细胞已沉淀到3D水凝胶中（图2C，E，G）。细胞是活的，但根据第2天和第7天的图像比较，增殖速率较低（图2A＆C）。图2E和G的3D视图显示，在常规VitroGel 3D - RGD中培养7天后，OP9细胞缺乏细胞间连接。另一方面，在VitroGel RGD - PLUS中培养的细胞表现出更多的3D成纤维细胞样形态，并形成了广泛的细胞间连接（图2D，F，H；图2F和H的3D视图）。

【讨论】

 我们的研究表明，我们的新VitroGel RGD - PLUS可以成为依赖细胞间网络的细胞应用的理想三维支架。细胞分化和身份由复杂的细胞 - 细胞通信调节，这只能通过可扩散配体在短距离内实现；这种行为在体外难以模拟。它可能导致体外和体内研究之间的变异性，从而阻碍转化研究。 对于组织再生，特别是间充质分化，与周围细胞通信的能力是绝对必要的。细胞通信通常通过细胞间的可扩散因子在相对短的距离内发生，这得益于三维环境提供的紧密接触。然而，更长距离的信号需要细胞通信网络。多项研究表明，不同种类的支架和不同的弹性可以驱动分化沿着不同的途径进行。VitroGel系统提供了一个足够可调的平台，以适应任何应用，减少变异性并简化过程。

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