Montana Molecular：Green Up cADDis cAMP生物传感器

G蛋白偶联受体（GPCR）是体内最大的信号受体家族，参与几乎所有的生理过程，并且是重要的药物靶点。由于GPCR信号传导的复杂性，在某些具体通路过程中的调控机理仍然存在争议，为此科学家们开展了进一步的研究。

1.GPCR信号传导的复杂性：传统观点认为，GPCR的信号传导主要发生在质膜上。然而，近年来越来越多的证据表明，许多GPCR在内化后仍能继续与G蛋白结合，从而在内体上启动信号传导。

2.内体cAMP信号传导的争议：对于许多GPCR，内体cAMP信号传导被认为是β-抑制蛋白（β-arrestin）依赖的，因为β-arrestin对于受体的内化和内体上信号的维持至关重要。然而，关于是否存在不依赖于β-arrestin的内体cAMP信号传导存在争议。

3.VIPR1受体的特殊性：血管活性肠肽受体1（VIPR1）是一种多肽激素受体，已知与β-arrestin结合，但其内化是否依赖β-arrestin尚不清楚。

Emily等人就cAMP信号传导是否依赖β-抑制蛋白（β-arrestin）发布表了在线研究《β-Arrestin-independent endosomal cAMP signaling by a polypeptide hormone GPCR》

研究方法

1. 细胞系和质粒构建

使用HEK293细胞系，通过CRISPR技术构建β-arrestin双敲除（β-arr DKO）细胞系，以研究β-arrestin在VIPR1内化及信号传导中的作用。

构建表达HaloTag-VIPR1、β-arr2-mApple等融合蛋白的质粒，用于细胞成像和流式细胞术分析。

2. cAMP信号检测

使用Montana Molecular品牌的Green Up cADDis cAMP生物传感器实时检测细胞内cAMP水平。该传感器基于FRET原理，能够高灵敏度地监测cAMP的动态变化。

在实验中，通过VIP刺激细胞，观察cAMP水平的瞬时变化，并比较野生型与β-arr DKO细胞系之间的差异。

3. 内吞和信号传导分析

通过流式细胞术和共聚焦显微镜观察VIPR1的内化过程；使用NanoBiT蛋白互补系统检测β-arrestin与VIPR1在内体和质膜上的结合情况； 通过阻断内吞途径或使用GRK抑制剂，进一步分析内吞和磷酸化对VIPR1信号传导的影响。

实验结果

1. VIPR1的内化不依赖β-arrestin

在β-arr DKO细胞中，VIP仍能诱导VIPR1的内化，且内化动力学与野生型细胞相似；使用流式细胞术和共聚焦显微镜观察到，VIP刺激后VIPR1从质膜转移到内体。

2. 内体cAMP信号传导不依赖β-arrestin

在β-arr DKO细胞中，VIP刺激仍能引发内体上的cAMP信号传导，尽管信号强度较野生型细胞减弱；NanoBiT实验表明，VIP刺激后，β-arr2能被招募到内体和质膜上的VIPR1，但在β-arr DKO细胞中，内体上的信号传导不受影响。

3. β-arrestin在信号传导中的新角色

通过比较野生型与β-arr DKO细胞的cAMP信号曲线，发现β-arrestin的主要作用是调节质膜和内体信号传导的时空分布；β-arrestin通过与质膜上的VIPR1结合，加速质膜信号传导的脱敏，从而使内体信号传导以第二个峰值的形式出现。

4. GRK磷酸化对内吞和信号传导的影响

使用GRK抑制剂Cmpd101发现，VIPR1在质膜上与β-arrestin的结合不依赖于GRK磷酸化，但在内体上则需要GRK磷酸化。这表明质膜和内体上的VIPR1-β-arrestin复合物具有不同的生化特性。

结论

1. 内体cAMP信号传导的新模式

VIPR1是首个被证实能在不依赖β-arrestin的情况下在内体上产生cAMP信号传导的GPC；这一发现挑战了传统的β-arrestin依赖模型，并提出了内体信号传导的新模式。

2. β-arrestin在信号传导中的新功能

β-arrestin不仅作为内吞适配蛋白和信号分子，还通过调节质膜和内体信号传导的时空分布来精细调控GPCR的信号输出；β-arrestin在质膜上形成信号衰减复合物，加速质膜信号传导的脱敏；而在内体上则形成信号中性复合物，不影响内体信号传导。

3. 对GPCR信号传导复杂性的新认识

本研究表明，GPCR信号传导的复杂性远超预期，不同GPCR在内吞和信号传导方面存在显著差异； 对VIPR1的研究为理解GPCR信号传导的多样性和复杂性提供了新的视角和方法。

在本研究中，Montana Molecular品牌的Green Up cADDis cAMP生物传感器（Cat#U0200G）在GPCR信号传导分析中发挥了关键作用，具体体现在以下几个方面：

1. 高灵敏度实时监测

Green Up cADDis cAMP生物传感器（Cat#U0200G）基于FRET原理，能够实时监测细胞内cAMP水平的微小变化。在本研究中，该传感器成功捕捉到了VIP刺激下cAMP水平的瞬时变化，为分析VIPR1信号传导提供了关键数据。

2. 适用于多种细胞系和实验条件

该传感器适用于多种细胞系，包括HEK293细胞等常用模式细胞。同时，它也适用于不同的实验条件，如药物刺激、基因敲除等。

3. 推动GPCR信号传导研究的发展

通过实时监测cAMP水平，Green Up cADDis cAMP生物传感器（Cat#U0200G）为GPCR信号传导的研究提供了强有力的工具。它不仅有助于揭示GPCR信号传导的分子机制，还有助于发现新的药物靶点和治疗策略。

综上所述，本研究通过深入分析VIPR1的内化和信号传导机制，揭示了GPCR信号传导的复杂性和多样性。同时，Green Up cADDis cAMP生物传感器（Cat#U0200G）在本研究中发挥了重要作用，为揭示VIPR1信号传导的动态过程提供了关键数据。这些发现不仅丰富了我们对GPCR信号传导机制的认识，还为未来药物研发提供了新的思路和方法。