Tymora Analytical:pIMAGO HRP Phosphoprotein Detection on Western Blot

文献标题：Autophosphorylation Inhibits RcCDPK1, a Dual-Specificity Kinase that Phosphorylates Bacterial-Type Phosphoenolpyruvate Carboxylase in Castor Oil Seeds

作者：Ryan Kilburn, Suzanne A. Gerdis, Yi-Min She, Wayne A. Snedden, William C. Plaxton等

DOI：https://doi.org/10.1093/pcp/pcac030

研究背景：

钙（Ca2+）在真核生物信号传导中扮演着关键角色，钙感应蛋白如钙调蛋白（calmodulin）作为Ca2+信号的重要转导者，响应外部刺激和发育信号。CDPKs是一类特殊的Ca2+感应蛋白，它们不仅感应Ca2+信号，还能催化下游蛋白的磷酸化事件，从而控制生理过程。这种信号属性的组合可能源自早期蛋白激酶基因与钙调蛋白基因的融合。CDPK家族在植物中呈现多样化，它们在表达模式、亚细胞位置、Ca2+敏感性、底物特异性以及通过脂质、磷酸化和蛋白互作的调控方面存在差异。尽管CDPKs在植物中广泛存在，但对它们的生物学功能和作用机理的理解仍不完全。特别是，目前识别的CDPKs的体内靶标相对较少。

该研究特别关注了蓖麻（Ricinus communis）中的CDPK1（RcCDPK1），它在蓖麻种子（COS）的油质内胚乳中催化BTPC的抑制性磷酸化。蓖麻种子由于其成熟时积累的油量比商业重要的油籽（如油菜籽）多20-40%，因此成为研究油籽代谢的重要模型。BTPC在植物代谢中扮演着关键的异源磷酸化酶的角色，特别是在C4光合作用和CAM光合作用中固定CO2的过程中。此外，非光合BTPC在支持生物合成和氮同化过程中的三羧酸循环中间体的补充中也具有重要作用。还进一步探讨了RcCDPK1的特异性，包括其对BTPC的磷酸化以及其自身的自磷酸化活性，还涉及了RcCDPK1的自磷酸化位点的鉴定和功能分析，以及这些位点如何影响其对BTPC的磷酸化活性。

研究内容：

研究了RcCDPK1的自磷酸化位点，并通过比较整体自磷酸化和特定Tyr30自磷酸化对RcCDPK1转移磷酸化BTPC底物Ser451能力的影响。发现RcCDPK1是一个双特异性激酶，能够在多个Ser、Thr和Tyr残基上自磷酸化。先前的全局自磷酸化显著减弱了RcCDPK1的催化活性，而Tyr30自磷酸化似乎为RcCDPK1转移磷酸化蓖麻BTPC在Ser451提供了准备。

研究方法：

使用大肠杆菌异源表达RcCDPK1，并进行了纯化和自磷酸化实验；利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）映射了RcCDPK1的自磷酸化位点；通过免疫印迹和放射性测定来评估自磷酸化对RcCDPK1转移磷酸化活性的影响；生成了针对RcCDPK1 Tyr30位点的特异性抗体，用于检测RcCDPK1的自磷酸化状态。

研究结论：

1、通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，研究者们确定了RcCDPK1在42个不同的丝氨酸（Ser）、苏氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）残基上的自磷酸化位点。这些位点包括了在RcCDPK1的N端可变域（NTVD）和催化结构域之间的保守酪氨酸残基Tyr30。

2、研究发现，RcCDPK1的全局自磷酸化显著减弱了其转移磷酸化BTPC底物在Ser451位点的能力。这表明自磷酸化可能对RcCDPK1的激酶活性具有负调控作用。

3、与全局自磷酸化的抑制作用不同，Tyr30位点的自磷酸化似乎为RcCDPK1转移磷酸化BTPC在Ser451位点提供了正向的调控。这表明Tyr30自磷酸化可能在RcCDPK1的活性调节中发挥着特定的作用。

4、研究还发现，无论是在自磷酸化前还是自磷酸化后，RcCDPK1都保持为由60-kDa亚基组成的同源二聚体结构，这表明自磷酸化并不改变其寡聚状态。

5、研究者们还观察了RcCDPK1对其他底物，如组蛋白III-S和拟南芥的ABA响应转录因子ABF4的磷酸化活性。结果表明，RcCDPK1的自磷酸化同样减弱了其对这些替代底物的磷酸化能力。

6、通过同源建模，研究者们预测了RcCDPK1及其同源物GmCDPKβ在Ca2+存在时的结构变化，发现Ca2+的结合可能导致RcCDPK1发生显著的构象变化，从而影响其催化活性。

研究结果揭示了RcCDPK1自磷酸化对其激酶活性的调控作用，特别是Tyr30位点的自磷酸化在调节RcCDPK1转移磷酸化BTPC中的重要性。这些发现为理解COS中异源磷酸化途径的翻译后调控、Ca2+依赖性信号传导以及RcCDPK1自磷酸化的生物学意义提供了新的见解。

在这篇文章中，pIMAGO（Tymora Analytical, West Lafayette, IN, USA）被用作一种磷蛋白试剂，用于检测蛋白质的磷酸化。pIMAGO是一种用于西方印迹（Western blot）的检测试剂，能够与蛋白质上的磷酸化氨基酸残基发生特异性反应，从而允许研究人员检测和定量蛋白质样品中的磷酸化水平。

pIMAGO HRP Phosphoprotein Detection on Western Blot (complete kit) - 40 mini-blots

货号：TMR-800-40

在这篇文章中的主要作用包括：

检测RcCDPK1的自磷酸化：文章中提到，通过使用pIMAGO试剂，研究人员能够检测到RcCDPK1（Ricinus communis Ca2+-dependent protein kinase-1）在体外实验中的自磷酸化活性。这表明RcCDPK1能够在特定条件下自我磷酸化，并且这种磷酸化状态可以通过pIMAGO试剂进行可视化。

比较不同磷酸化状态下的RcCDPK1活性：研究人员使用pIMAGO试剂来比较经过不同处理（如经过λ-磷酸酶处理的去磷酸化RcCDPK1和经过自磷酸化处理的超磷酸化RcCDPK1）的RcCDPK1样品的磷酸化状态。通过这种比较，研究人员发现自磷酸化显著减弱了RcCDPK1转移磷酸化其BTPC（细菌型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）底物的能力。

验证磷酸化位点特异性抗体：研究人员还利用pIMAGO试剂来验证针对特定磷酸化位点（如Tyr30）的抗体的特异性。通过比较pIMAGO试剂与这些特异性抗体的检测结果，可以进一步确认这些位点在RcCDPK1功能中的重要性。

总的来说，pIMAGO试剂在这篇文章中发挥了关键作用，帮助研究人员揭示了RcCDPK1的自磷酸化特性及其对BTPC底物磷酸化活性的影响，为理解植物中钙依赖性信号传导和代谢调控提供了重要信息。

pIMAGO的主要应用：

pIMAGO它不仅可以用于西方印迹（Western blot）来检测特定样品中的磷酸化蛋白质，还可以用于其他多种蛋白质磷酸化研究，包括但不限于：

1、细胞信号传导研究：检测细胞在特定刺激下，信号传导途径中关键蛋白的磷酸化状态变化。

2、蛋白质功能研究：研究蛋白质的磷酸化对其活性、稳定性、亚细胞定位和相互作用的影响。

3、疾病机理研究：在疾病状态下，特别是与信号失调相关的疾病，如癌症、糖尿病等，检测特定蛋白质的磷酸化水平变化。

4、药物筛选和机制研究：评估潜在药物对特定蛋白质磷酸化的影响，以及这些变化如何影响细胞功能和疾病进程。

5、蛋白质组学研究：在大规模蛋白质磷酸化分析中，鉴定和定量磷酸化蛋白质和磷酸化位点。

6、免疫沉淀（IP）实验：结合特异性抗体，富集特定磷酸化蛋白质，然后使用pIMAGO进行检测。

7、流式细胞术：在某些情况下，pIMAGO或类似试剂也可以用于流式细胞术，以分析细胞表面磷酸化蛋白质的表达。

8、时间分辨荧光共振能量转移（TR-FRET）：在某些基于FRET技术的磷酸化检测中，pIMAGO或类似发光检测试剂可以用于检测。

pIMAGO试剂的应用范围取决于其与特定实验设计和研究目标的兼容性，以及它在检测特定类型磷酸化氨基酸（如磷酸酪氨酸、磷酸苏氨酸或磷酸丝氨酸）方面的性能。在任何应用中，选择合适的检测系统和对照对于确保结果的准确性和可靠性至关重要