Synaptic Systems：抗m7G-cap小鼠单克隆抗体

大多数真核mRNAs以典型的帽依赖性方式翻译。为了启动翻译，三元复合物 (eIF2-GTPMet-tRNAi)被装载到40S核糖体亚单位上，形成43S预起始复合物 (PIC)，然后通过由帽结合蛋白eIF4E、支架蛋白eIF4G和RNA解旋酶eIF4A组成的eIF4F复合物被招募到mRNA的m7G封端5’端。聚 (A)结合蛋白 (PABP)促进了43S PIC向50帽的募集，该蛋白通过与eIF4F复合物中的eIF4G相互作用，从mRNA的30聚 (A)尾环回。在对应激的反应中，通常通过应激诱导的eIF2a磷酸化来抑制一般翻译的启动，这降低了活性三元复合物的可用性。某些应激反应性mRNAs，例如酵母中的一般控制非抑制性4 (GCN4)和哺乳动物中的激活转录因子4 (ATF4)，其翻译通常受到其mRNAs中上游开放阅读框 (uORFs)的抑制，优先翻译三元复合物的水平降低。然而，在植物中，尽管在包括模式触发免疫 (PTI)在内的许多应激反应中观察到eIF2a磷酸化，但在GCN2突变体中阻断这一过程对生物和非生物应激反应没有影响。

2022年7月29日，来自美国杜克大学的Jinlong Wang及其团队在Cell (IF: 38.637)杂志上发表名为PABP/purine-rich motif as an initiation module for cap-independent translation in pattern-triggered immunity的研究。

本文研究了植物在应对病原体感染时的翻译调控机制，特别是模式触发免疫（PTI）信号通路如何通过非帽依赖性翻译机制促进应激诱导的翻译组重编程。传统的翻译起始通常依赖于mRNA的5'端的帽子结构（m7G-cap），然而在植物中，PTI信号通路并不依赖于GCN2/eIF2α通路来抑制一般翻译，而是通过一种非帽依赖性翻译机制选择性翻译防御相关mRNA。这种机制对于植物在应对生物和非生物胁迫时快速调整翻译组，优先合成防御蛋白至关重要。

研究亮点

1、PTI利用R基序作为IRES效应来诱导mRNA的脱帽和防御mRNA的翻译。

2、PABPs 通过与 eIFiso4G 的关联而不是 eIF4G 激活 R 基序介导的翻译。

3、MPK3/6在PTI期间使用RACK1作为支架磷酸化eIF4G、PABP和eIF4G。

4、磷酸化抑制eIF4G，同时激活PABP/eIF4G介导的翻译。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2022.06.037

实验材料与试剂：

实验材料：拟南芥（Arabidopsis thaliana）和本氏烟草（Nicotiana benthamiana）植株。

试剂：Synaptic Systems品牌的anti-m7G-cap mouse monoclonal antibody（货号：SYS-201-011）用于检测mRNA的帽子结构，以及其他用于分子生物学和生物化学实验的常规试剂。

实验结果：

mRNA脱帽活性检测：实验发现，在elf18（一种细菌延伸因子Tu的N端表位）诱导下，植物体内mRNA的脱帽活性显著增加，特别是防御相关mRNA如TBF1的脱帽程度显著高于看家基因UBQ10。这表明PTI信号通路通过增加mRNA脱帽活性来抑制一般翻译，同时选择性促进防御mRNA的翻译。

R-motif作为内部核糖体进入位点（IRES）的功能验证：通过突变TBF1 mRNA 5'UTR中的R-motif，发现这些突变显著降低了elf18诱导的翻译活性，表明R-motif在促进防御mRNA翻译中起关键作用。体外翻译实验进一步证实了R-motif可以不依赖于帽子结构促进mRNA翻译。

PABP与eIF4G及eIFiso4G的相互作用：分裂荧光素酶互补实验和Co-IP实验表明，PABP在elf18诱导下优先与eIFiso4G结合，而与eIF4G的结合减弱。这表明PABP通过动态调整与不同eIF的结合来促进防御mRNA的翻译。

磷酸化分析：使用phos-tag凝胶电泳和LC-MS/MS分析发现，elf18诱导下PABP、eIF4G和eIFiso4G发生磷酸化修饰。特别是PABP的S566位点被MPK3/6激酶磷酸化，增强了其与R-motif的结合能力。磷酸化位点的突变体实验进一步证实了磷酸化在调控PABP功能中的重要性。

植物抗病性测试：通过接种病原细菌测试发现，PABP、eIF4G和eIFiso4G的突变体植物在PTI诱导的抗病性方面表现出不同表型。特别是eIFiso4G的突变显著降低了植物的抗病性，而eIF4G的突变则增强了基础抗性但不影响PTI诱导的抗病性。

结论

本研究揭示了植物在应对病原体感染时通过一种新颖的非帽依赖性翻译机制来快速调整翻译组，优先合成防御蛋白。这一过程涉及mRNA的脱帽、R-motif作为IRES促进翻译、PABP与不同eIF的动态相互作用以及MPK3/6激酶介导的磷酸化修饰。这些发现不仅增进了我们对植物免疫机制的理解，也为未来开发新型植物保护策略提供了理论依据。

Synaptic Systems品牌的anti-m7G-cap mouse monoclonal antibody（货号：SYS-201-011）在本研究中发挥了关键作用，主要体现在以下几个方面：

mRNA脱帽活性的量化：该抗体能够特异性识别mRNA的5'端帽子结构（m7G-cap），通过免疫沉淀（IP）结合qPCR技术，可以准确量化mRNA的脱帽程度。这对于评估PTI信号通路对mRNA稳定性的影响至关重要。 

验证非帽依赖性翻译机制：在研究非帽依赖性翻译机制时，需要排除帽子结构对翻译的影响。该抗体能够帮助确认mRNA是否确实失去了帽子结构，从而支持R-motif作为IRES功能的结论。 

提高实验的可靠性和准确性：使用高质量的特异性抗体可以减少非特异性结合和背景信号干扰，提高实验数据的可靠性和准确性。这对于科学研究来说至关重要，尤其是在探索复杂生物过程的分子机制时。 

促进相关领域的研究发展：该抗体的应用不仅限于本研究领域，还可以推广到其他涉及mRNA稳定性和翻译调控的研究中。随着对mRNA代谢和翻译调控机制理解的深入，该抗体将成为更多相关研究中的重要工具。 

Synaptic Systems品牌的m3G-cap, m7G-cap antibody - 201 011，在本研究中发挥了不可或缺的作用，不仅帮助揭示了植物PTI信号通路中的新型翻译调控机制，还为相关领域的研究提供了有力支持。