多组氨酸或His 6标签是一种蛋白质标签,最初于1988年开发,用于高效纯化蛋白质而开发的蛋白标签。由于其相对较高性价比,它被认为是迄今为止最广泛使用的蛋白质亲和标签之一。由于其小尺寸,可在四到十个氨基酸之间变化,His很少干扰目标蛋白质的功能。此外,其低免疫原性和在天然及变性条件下的多功能性,使这种蛋白质标签在众多标签中脱颖而出。His标签的底层纯化原理是金属离子与组氨酸的咪唑环之间的相互作用。
His-tag的特点 | |
氨基酸序列 | HHHHHH (4-10) |
DNA序列 | 5'-CAT CAC CAT CAC CAT CAC-3' |
分子量 | 840.8 Da (His6) |
与重组蛋白的相容性 | 可以加到蛋白质的N端或C端 |
相互作用特异性(KD) | 10 ?M |
蛋白产量/ml纯化树脂 | 高达80 mg/ml (GFP-His) |
洗脱条件 | 咪唑,组氨酸,或pH值变化(pH值4-5) |
通过His标签对蛋白质进行纯化是通过不同的二价金属离子(如Ni2+,这是最常用的离子)与组氨酸的基本咪唑环之间的相互作用来实现的。His标签能够在中性到略微碱性的pH值(7.5至8是典型的)下与这些金属离子结合。值得注意的是,这两种相互作用伙伴之间的结合亲和力与His标签的长度成正比。与His6标签相比,His10标签能够实现十倍的结合亲和力。然而,作为首次尝试,建议尽量减少组氨酸残基的数量,以避免可能对蛋白质功能造成干扰。在纯化过程的后期阶段,可以通过将pH值降低到4-5来洗脱蛋白质,尽管应该注意到有些蛋白质在这样的低pH值下会发生变性。此外,大多数科学家更倾向于通过更高浓度的咪唑(100-500 mM)进行竞争性洗脱。还建议在装载和洗涤缓冲液中加入低摩尔浓度的咪唑(5-20 mM,很少达到80 mM),以减少非特异性结合事件,因为一些内源性蛋白质或天然存在的组氨酸能够对IMAC树脂显示出微弱的结合。每种蛋白质的最佳条件应始终单独确定。
亲和纯化步骤
1. 结合:含有His标签蛋白质的粗溶液被加到柱子上,并基于亲和标签-基质相互作用进行结合。
2. 洗涤:其他非特异性结合的蛋白质被适当的洗涤缓冲液冲走。这些缓冲液中应该已经含有低摩尔浓度的咪唑。
3. 洗脱: 特异性结合的蛋白质从柱子上洗脱,通常是通过类似分子的竞争性结合(例如组氨酸和咪唑)、通过蛋白酶切割标签,或者通过改变pH值破坏亲和标签-基质相互作用来实现。然后可以将纯化的洗脱液收集到反应管中,以供进一步研究。
通过His标签的蛋白质纯化通常是通过固定金属亲和色谱法(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)实现的。这是一种广泛使用的纯化方法,用于从溶液中分离对金属离子(如Ni2+或Co2+)具有亲和力的蛋白质和肽段。对蛋白质进行His标签化,可以使新形成的融合蛋白与螯合金属结合,从而在很少的步骤中实现大量的富集。常用的螯合剂作为配体是IDA和NTA琼脂糖树脂。它们可以很容易地与二价金属配对,这取决于所需过程的亲和力/特异性比率。
三种配体(IDA,NTA&INDIGO-Ni)及其镍结合能力的比较
配体 | 配位位点 | 镍结合 |
IDA | 3 | 弱 |
NTA | 4 | 中 |
INDIGO | 5 | 强 |
选择正确的His标签纯化树脂或磁珠的类型基于三个因素:
配体:这是金属离子在螯合物复合物中与之结合的分子。Cube Biotech可提供三种不同的配体。
NTA:氨三乙酸是最常用的配体。
IDA:亚氨基二乙酸是第二常用的配体。NTA对比IDA:IDA树脂价格较低;NTA树脂能得到纯度更高的蛋白;NTA树脂的金属离子脱落量明显较少;NTA树脂对还原剂和螯合剂有更强的抵抗力。
INDIGO:这种配体是在Cube Biotech开发的。它的优势之一是大大提高了DTT和EDTA的耐受性。这种新型INDIGO配体装载镍离子。使用INDIGO配体,使得在高达20 mM DTT和20 mM EDTA的高蛋白质容量下纯化his标记的蛋白质成为可能。
耦合的金属离子:根据与配体耦合的金属离子,His标签纯化的亲和力和特异性会发生变化。铜具有最高的亲和力,但同时具有最低的特异性。钴则位于光谱的另一端。镍是最常用的金属离子,它在亲和力和特异性之间取得了良好的平衡。经验法则:蛋白质产量越高,纯化过程的特异性就越低。
珠子的大小:使用的珠子直径越大,FPLC纯化的流速越高。这使它们更适合粘稠的细胞介质或批量纯化。然而,通常使用较慢的流速可以增加蛋白质产量,因为较小的珠子具有更高的表面积与体积比。因此,相同体积的树脂可以比更大尺寸的珠子结合更多的蛋白质。Cube Biotech提供的珠子直径有30微米、40微米、100微米和XL尺寸(约400微米)。
Cube Biotech 作为蛋白纯化的专业供应商可提供His标签蛋白纯化的树脂、填料和试剂盒:
配体 | 货号 | 名称 | 产品类型 | 用途 |
INDIGO | PureCube 100 Ni-INDIGO Agarose | 磁珠/琼脂糖填料 | 6x His标签蛋白的特异性结合和纯化 | |
75225 | PureCube Ni-INDIGO MagBeads | |||
75302 | PureCube 100 Compact Cartridge Ni-INDIGO | 纯化柱 | ||
80201 | Ni-INDIGO MagBead Protein Purification MINI Kit | 试剂盒 | ||
80101 | Ni-INDIGO His-Tag Protein Purification MINI Kit | |||
80105 | Ni-INDIGO His-Tag Protein Purification MIDI Kit | |||
NTA | 55105 | PureCube Ni-NTA Agarose XL | 磁珠/琼脂糖填料 | |
74103 | PureCube 100 Ni-NTA Agarose | |||
PureCube Ni-NTA Agarose | ||||
55305 | PureCube Ni-NTA MagBeads XL | |||
31201 | PureCube Ni-NTA MagBeads | |||
31302 | PureCube Compact Cartridge Ni-NTA | 纯化柱 | ||
74302 | PureCube 100 Compact Cartridge Ni-NTA | |||
IDA | 55003 | PureCube Ni-IDA Agarose XL | 磁珠/琼脂糖填料 | |
30112 | PureCube Ni-IDA Agarose | |||
55225 | PureCube Ni-IDA MagBeads XL | |||
30205 | PureCube Ni-IDA MagBeads | |||
30304 | PureCube Compact Cartridge Ni-IDA | 纯化柱 |
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