Hypoxyprobe：HP - 100 试剂盒

发布者：艾美捷科技发布时间：2024-10-18

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解析文章《Tumour reoxygenation after intratumoural hydrogen peroxide (KORTUC) injection: a novel approach to enhance radiosensitivity》

作者：

Samantha Nimalasena ^1,2,5 , Selvakumar Anbalagan ^1,5 , Carol Box ¹ , Sheng Yu ¹ , Jessica K. R. Boult ¹ , Nigel Bush ¹ , Louise Howell ³ ,Victoria Sinnett ² , William Murphy ⁴ , John Yarnold ¹ , Simon P. Robinson ¹ and Navita Somaiah ^{1,2 ?}

链接：https://www.ahajournals.org/doi/full/10.1161/CIRCRESAHA.118.314438

一、研究背景

1.肿瘤缺氧与放疗抗性

肿瘤缺氧是放疗抗性的一个重要原因。自 20 世纪 50 年代 Gray 等人的开创性研究以来，人们一直在寻求增加氧合以提高放疗效果的策略。

2.KORTUC 的潜在作用

前期临床和临床研究报道了瘤内注射过氧化氢（H?O?）作为实体瘤潜在放疗增敏剂的可能性。KORTUC 是将 H?O?与 0.83% 透明质酸钠凝胶混合制成的 0.5% H?O?溶液，用于体内注射，以确保稳定性并减少注射疼痛。作者所在的 I 期临床试验已证实其在局部晚期乳腺癌中的安全性，并显示出有希望的肿瘤反应。当 H?O?与电离辐射联合应用于放疗抗性细胞系和小鼠肿瘤模型时，观察到增强的细胞毒性作用和显著的肿瘤生长延迟，其机制不仅与辐射导致的 DNA 损伤增强有关，还涉及溶酶体膜透化、重金属离子释放、线粒体膜破坏和细胞凋亡等。瘤内注射 KORTUC 后，H?O?分解产生水和氧气，或在亚铁离子存在下产生氧气和羟基自由基，氧气微泡的形成可用于引导药物在肿瘤内的传递，这促使作者研究其是否可通过再氧合作用来增强放疗敏感性。

二、研究方法

1.细胞培养

培养人 HCT116 结直肠癌细胞和 LICR - LON - HN5 头颈部癌细胞，使用 Dulbecco’s modified eagle’s medium 补充 10% 胎牛血清，在特定条件下培养，并通过短串联重复（STR）分析和 PCR 分析对细胞系进行验证和支原体检测。

2.药物制备

在完全细胞培养基中制备过氧化氢的系列稀释液（0 - 9.6 mM）。对于瘤内 KORTUC 注射，将 3% v/v 过氧化氢与透明质酸钠凝胶混合，在无菌条件下制备成最终临床浓度为 150mM 0.5% v/v 的溶液。

3.Spheroid 实验

（1）将细胞接种在超低附着 96 孔板中形成球状体。在第 4 天，用不同浓度的 H?O?处理球状体。

（2）对于缺氧的免疫组化检测，球状体在固定前用 200?M pimonidazole（Hypoxyprobe? - 1，HP - 100）孵育 24h，然后进行一系列处理和染色，包括用抗 pimonidazole 抗体检测生物还原加合物以及用 DAPI 复染细胞核等，并对球状体直径和平均荧光强度进行量化。

（3）对于实时缺氧成像，球状体用 5?M Image - iT? Red Hypoxia Reagent 孵育 24h，然后用相同浓度范围的 H?O?处理，在不同时间点获取明场和荧光图像。

4.Xenograft 实验

（1）将肿瘤细胞注射到六周龄雌性 Foxn1 裸鼠皮下，当肿瘤体积达到约 400mm? 时进行处理，将小鼠随机分为三组：非注射对照组、载体注射对照组（仅透明质酸钠）和 KORTUC 组（透明质酸钠 + H?O?）。

（2）瘤内 KORTUC 注射时，小鼠经腹腔注射麻醉，在超声引导下进行注射，注射后对肿瘤进行不同时间的观察和处理。

5.Dual hypoxia marker 技术

通过腹腔注射 2 - nitroimidazole CCI - 103F（Hypoxyprobe - F6，HP4 - 100）确定基线肿瘤缺氧情况，然后在超声引导下瘤内注射 KORTUC 或载体，再腹腔注射 pimonidazole（Hypoxyprobe，60mg/kg），最后处死小鼠，获取肿瘤组织进行一系列处理和染色，包括用不同抗体检测相关标记物，并进行图像采集和分析。

6.图像分析

使用 cellSens 和 Fiji（ImageJ 应用）对图像进行分析，包括定义和量化缺氧加合物形成，确定再氧合区域，以及对 phospho - ATM 焦点进行量化等。

三、Hypoxyprobe 品牌的 HP - 100 试剂盒产品的作用和价值

产品链接：

http://site.hypoxyprobe.com/knowledge-center-articles/MSDS_HP_2_24.pdf

Substance Name ：Pimonidazole Hydrochloride

Brand Name ：Hypoxyprobe?-1

Company ：Hypoxyprobe, Inc (HPI)

1.在 Spheroid 实验中的作用

在球状体缺氧的免疫组化检测中，使用 Hypoxyprobe? - 1（HP - 100）试剂盒中的 pimonidazole。球状体在固定前用 200?M pimonidazole 孵育 24h，通过检测生物还原加合物来确定缺氧情况。这对于研究 H?O?处理对球状体缺氧的影响至关重要，能够提供球状体内部缺氧状态的准确信息，帮助研究人员了解不同浓度 H?O?处理下球状体缺氧的变化规律。

2.在 Xenograft 实验中的作用

在 Dual hypoxia marker 技术中，首先腹腔注射 2 - nitroimidazole CCI - 103F（Hypoxyprobe - F6，HP4 - 100）来确定基线肿瘤缺氧情况。然后在瘤内注射操作后，又腹腔注射 pimonidazole（Hypoxyprobe，60mg/kg）来进一步检测肿瘤缺氧的变化。这些操作能够全面、准确地评估瘤内注射 KORTUC 前后肿瘤缺氧状态的改变，为研究肿瘤再氧合机制提供了关键的数据支持。

Hypoxyprobe? F6 Kit

(HPI Catalog # HP4-XXX)

Kit contents:

Solid CCI-103F (Hypoxyprobe?-F6)

Diluted Rabbit anti-CCI-103F antisera (PAbF6)

应用: 使用Hypoxyprobe?-F6 Kit通过免疫化学检测（包括免疫过氧化物酶、免疫荧光或流式细胞术）测量组织和细胞中的缺氧。

3.总体价值

Hypoxyprobe 品牌的相关试剂盒产品为研究肿瘤缺氧和再氧合提供了有效的工具。通过使用这些试剂盒中的试剂，可以准确地标记和检测肿瘤组织及球状体中的缺氧区域，使得研究人员能够定量分析缺氧程度的变化，对于深入了解 KORTUC 对肿瘤缺氧的影响以及其放疗增敏机制具有不可替代的价值。

四、实验结果

1.H?O?诱导的再氧合在 3D 球状体模型中呈剂量和时间依赖性

Pimonidazole 加合物形成证实了 HCT116 和 HN5 球状体模型中存在缺氧。Image - iT? Red 荧光在 H?O?处理后 1h 呈剂量依赖性降低，在 [H?O?]≥1.2 mM 时显著，与球状体再氧合一致。在 HCT116 球状体中，缺氧降低可持续到处理后 6h（≥2.4 mM H?O?），但在 24h 时荧光重新出现，表明缺氧再次出现。H?O?处理 24h 后对球状体进行 pimonidazole 加合物染色也进一步证实了球状体再氧合，且在 [H?O?]>1.2 mM 时观察到该效果。

2.超声成像证实瘤内 KORTUC 注射后 O?持续释放

在临床和实验中，瘤内注射 KORTUC 后会立即形成氧气微泡，在异种移植模型中也观察到了这种现象。对 HCT116 肿瘤的超声成像显示，氧气微泡的回声性逐渐降低，但在注射后可持续 1h，而注射透明质酸钠时未观察到微泡形成，证实瘤内 H?O?可导致氧气微泡持续释放。

3.瘤内 KORTUC 显著降低 HCT116 和 HN5 异种移植物的肿瘤缺氧

通过对 CCI - 103F 和 pimonidazole 加合物形成的量化，发现瘤内 KORTUC 注射导致两种异种移植物模型中的肿瘤缺氧显著降低，与载体或非注射对照组相比，差异显著。而注射透明质酸钠的肿瘤缺氧降低不显著。

4.KORTUC 治疗导致 phospho - ATM 焦点增加，提示再氧合和 ROS 增加

在 HCT116 异种移植物中，对 phospho - ATM 焦点进行评分，发现 KORTUC 注射组中 > 5 phospho - ATM 焦点的细胞显著多于对照组。在 CCI - 103F 阳性和阴性细胞中均有此现象，推测 CCI - 103F 阳性细胞中增加的 phospho - ATM 表达可能是由于 ROS 和 / 或再氧合诱导的 ROS 的共同作用，而 CCI - 103F 阴性细胞中可能是由于 ROS 单独作用。