Biotium：PMA-qPCR细菌活力检测

一、Viability PCR(v-PCR，活力PCR ) 简介

可靠地检测活微生物和病毒引起了众多领域的广泛兴趣，包括基础研究、食品安全、农业和公共卫生。然而，测量微生物活力的传统方法依赖于耗时的培养、菌落计数或显微镜观察。此外，某些生物不能用当前技术培养。因此，这些可行但不可培养的 (VBNC) 物种需要分子的生存能力测量。活力PCR (v-PCR) 是一种可靠且无需培养的方法，可灵敏且快速地检测微生物的活力。自2006 年以来，Biotium通过开发PMA(单叠氮化丙锭)和改进的PMAxx v-PCR染料开创了v-PCR领域，通过 qPCR 选择性检测活细菌方面非常有用。

使用PMA和PMAxx 的v-PCR的优势：

无需耗时的培养、显微镜检查或菌落计数即可进行灵敏且快速的生存力分析；

允许进行菌株特异性生存力分析；

已针对数十种细菌、真菌和病毒物种进行验证和发布；

与下一代测序应用兼容；

适用于复杂样品类型，包括土壤、粪便、水/废水、生物标本和食品；

v-PCR 的行业领导者

PMA是行业领导者首选的v-PCR 染料，并已在数百份同行评审的论文和大量细菌、真菌和病毒菌株中得到验证。早期研究侧重于细菌中的v-PCR，验证了在数十种不同细菌菌株中的程序，例如大肠杆菌、李斯特菌、军团菌、乳酸杆菌、结核分枝杆菌、衣原体、幽门螺杆菌以及许多其他与人类健康相关的菌株. v-PCR 在细菌中的应用最为广泛，但也有许多引文在酵母和真菌、病毒以及各种其他细胞类型（如古生菌、变形虫和寄生虫）中使用 v-PCR。

二、已验证的Viability PCR应用实例：

微生物组研究

环境测试

益生菌研究

临床测试

食品和水卫生

葡萄酒发酵

微生物测序

1. 测量环境样品中细菌的活力

在本文中，我们选择了三篇关于v-PCR与PMA和PMAxx 引文介绍了如何用v-PCR监测废水、淡水和饮用水处理厂采集的样本中的细菌活力。

2. 用PMA或PMAxx 研究病毒完整性

v-PCR是一种已被证实的监测数十种病毒株衣壳完整性的方法，包括严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型。

下图显示了过去十年（2009年至2021年）在食品安全和环境病毒学领域的同行评审研究中，使用v-PCR监测衣壳完整性所调查的病毒属和株数。

在本文中我们选择了三份引文，其中包含关于PMA或PMAxx 如何与qPCR相结合，来灵敏、准确、快速地检测完整的病毒衣壳。

三、V-PCR的工作原理

下面的信息图显示了v-PCR的基本机制，PMAxx 和PMA是对DNA具有高亲和力的光活性染料。染料插入dsDNA并在暴露于强烈可见光时形成共价键。该反应通过在纯化过程中去除修饰的DNA和通过DNA聚合酶抑制模板扩增的组合来抑制修饰的DNA模板的PCR扩增。由于染料是细胞膜不可渗透的，当用染料处理含有活细菌和死细菌的样品时，只有细胞膜受损的死细菌才容易受到DNA修饰。在qPCR反应中，死细胞DNA将显示出延迟扩增和比活细胞更高的Ct。

活性PCR染料，如PMAxx 或PMA是膜不渗透的，这使它们具有死细胞特异性。一旦进入死细胞，它们就会与DNA结合。暴露在强烈的可见光下会使染料具有活性，并使它们共价附着在DNA上，这种DNA修饰防止了随后的PCR反应中的扩增。

v-PCR工作流程：

v-PCR的基本工作流程如下图所示（详细协议可在产品页面上找到）。它适用于许多不同的样本类型和实验设置。对于少量培养物，样品可以在微型离心管中制备，并在PMA-Lite 2.0 LED光解装置中暴露在光下。

许多出版物已经将基本协议的修改用于特殊应用。例如，对于大的稀释体积，可以将样品过滤到膜上，然后对膜本身进行染料处理和光解。不透明、复杂的样品，如土壤或粪便，通常需要更高的染料浓度和更长的光照时间；样品稀释也有帮助。一些用户选择直接对细菌裂解物进行qPCR，而不是首先纯化DNA。

基本的v-PCR工作流程包括以下5个步骤：染料添加、培养、光照、DNA提取和qPCR。

四、PMA & PMAXX V-PCR 染料

PMA在数百篇针对各种菌株的期刊文章中得到验证

自Biotium首次开发PMA以来，已有数百篇关于染料在许多样品类型中的应用的出版物，包括数十种细菌菌株、生物膜、酵母、真菌、病毒和真核细胞。它已用于食品和水安全以及环境测试等应用，并已与qPCR、NextGen测序(NGS)、Sanger测序和环介导等温扩增 (LAMP) 结合使用。

PMAxx 是PMA的卓越替代品

虽然PMA通常可通过qPCR有效区分活细菌和死细菌，但它并不能完全消除死细胞DNA中的PCR产物。这可能会产生假阳性结果。PMAxx 由Biotium科学家设计，旨在成为PMA的卓越替代品。PMAxx 在消除死细胞DNA的PCR扩增方面更有效，因此可以最好地区分活细菌和死细菌。

相关产品推荐：

Viability PCR入门套件

可定制的 Viability PCR 入门套件包含使用 PMA 或 PMAxx 活力染料和 qPCR 选择性检测活细胞所需的材料。这些试剂盒可用于您选择的任何细胞类型（有关已发布的经过验证的细胞类型，请参阅PMA/PMAxx 参考列表和经过验证的细菌菌株列表）。所有试剂盒均包含 Forget-Me-Not EvaGreenqPCR Master Mix，以及您选择的 PMA 或 PMAxx 染料。您还可以选择带有或不带有革兰氏阴性细菌增强剂（不适用于其他细胞类型）的试剂盒。用户将需要提供自己的引物来扩增他们感兴趣的物种（请参阅此 博客文章 用于引物设计考虑）。每个试剂盒包含的试剂足以处理 80 种细菌培养物并进行200次PCR反应。

试剂盒包括：

PMA 染料或 PMAxx 染料

Forget-Me-Not EvaGreen qPCR预混液

ROX 参考染料

PMA 增强剂（仅限革兰氏阴性菌株）

不包括但需要：

用于扩增您感兴趣的细胞类型的引物

DNA 提取试剂盒或试剂

相关产品推荐：

PMA增强剂

PMA Enhancer for Gram Negative Bacteria 旨在提高活力PCR期间对活的革兰氏阴性菌和死的革兰氏阴性菌的区分。PMA增强剂以5X溶液的形式提供，并在添加活性染料之前添加到样品中。当来自革兰氏阴性细菌的序列通过PCR扩增时，用增强剂预处理的样品显示来自死细胞的信号减少，而来自活细胞的信号没有变化。PMA Enhancer 与 PMAxx 和 PMA兼容。PMAxx plus Enhancer是对革兰氏阴性菌进行活力PCR的最佳方式。PMA Enhancer可作为独立产品使用，也是我们 PMA 细菌活力试剂盒（仅限革兰氏阴性菌株）的组成部分（见下文）。

增强剂改善活/死区分的机制尚未确定。它可以提高死细胞壁或膜对染料的被动渗透性，以及提高染料与死细胞DNA的接触。

革兰氏阴性菌PMA增强剂相关产品推荐：

五、光活化装置PMA-Lite

PMA-Lite LED 光解装置允许对微量离心管中经 PMAxx 或PMA处理的样品进行时间和温度控制的光处理。

PMA-Lite 的特点：

为多达18个微量离心管提供均匀照明

内部风扇保持温度< 37°C

曝光时间为10、15、20 或 30 分钟的四种定时器设置

发射波长为465-475 nm的耐用LED灯

使用 PMAxx 染料可获得最佳效果

六、菌株特异性 V-PCR 试剂盒

菌株特异性v-PCR 试剂盒设计用于使用PMAxx 或PMA染料和实时 PCR 选择性检测来自特定菌株的活细菌。该试剂盒包含PMA染料或PMAxx 染料、Forget-Me-Not EvaGreen qPCR 预混液和经过验证的 PCR 引物，用于检测对食品安全、公共卫生和/或抗菌研究具有广泛意义的选定细菌菌株。

Kit组分包括：

PMA 染料或 PMAxx 染料

Forget-Me-Not EvaGreen qPCR预混液

ROX 参考染料

PMA 增强剂（仅限革兰氏阴性菌株）

针对特定细菌菌株的经验证的 PCR 引物

PMA实时PCR细菌活力试剂盒可用于鉴定如下菌株：

肠道沙门氏菌

结核分枝杆菌

金黄色葡萄球菌

金黄色葡萄球菌（耐甲氧西林）

单核细胞增生李斯特氏菌

大肠杆菌

大肠杆菌 O157:H7

嗜肺军团菌

菌株特异性细菌活力 PCR 试剂盒：