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Milenia Biotec GmbH：HybriDetect 2T：MGHD 21

发布者：艾美捷科技发布时间：2024-02-01

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用于同时检测用FITC、生物素和地高辛标记的两种不同分析物（蛋白质、基因组扩增产物）的通用侧流式试纸条

REF: MGHD 2 1

规格：100 Texts

MGHD 2 1.png

注意：重要更改在边缘处用虚线表示。在说明书的最后，您将找到一张列出引入更改原因的表格。

一、符号解释

MGHD 2 1-1.png

二、警告和注意事项

1.所有试剂应在原始容器中存放在 2-8 ℃的环境中。

2.使用前，将所有试剂恢复至室温（18-28 ℃）。

3.必须遵守所有组分的有效期限。

4.保护检测条免受湿气影响；容器必须始终密封。

5.只接触和标记检测条的箔纸覆盖区域（标记区域）。

6.废弃物的处理必须按照当地的法规进行。

7.检测缓冲液含有抗微生物试剂，因此避免与皮肤和/或黏膜接触。

8.适用于专业用户。

三、预期用途

HybriDetect 2T是一种通用侧流式试纸条，用于同时检测用FITC、生物素和地高辛标记的两种不同分析物（蛋白质、基因组扩增产物）。

它是一个开发平台。它是一个开发平台。

该测试仅供研究使用，不用于诊断目的。

四、提供的材料、储存和稳定性

组分	货号	规格	准备	储存	保质期
HybriDetect 2T试纸条：膜上涂有生物素配体和多克隆（山羊）地高辛抗体；结合物：多克隆（山羊）抗FITC抗体标记的金颗粒	MGDS2A	2×50次	即开即用	2-8℃ 容器必须始终密封（防潮）！	保质期至到期日
HybriDetect测定缓冲液：柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液	MGCBB	2瓶每瓶10ml	即开即用	2-8℃	保质期至到期日

可根据要求或从公司网站（www.milenia-biotec.de）获取材料安全数据表（MSDS）。

五、所需材料（不包括在内）

1、移液管

2、移液管尖（含有PCR的保护性过滤器）

3、反应管或96孔微孔板

六、必要的开发工作-开发平台

开发一个含有两种不同标记的探针用于分析物的溶液。以下条件是必要的：

1）溶液A：探针必须标记为：

·FITC（异硫氰酸荧光素）或FAM（羧基荧光素）

·生物素

2）溶液B：探针必须标记为：

·FITC（异硫氰酸荧光素）或FAM（羧基荧光素）

·地高辛

3）在检测过程中使用约100 uL的液体（样品和分析物特异性溶液A和B）。

4）提供的缓冲液（MGCBB）可用作这些分析物特异性溶液的基础缓冲液。

使用示例：

20微升样品和80微升特定于分析物的溶液，孵育时间为5分钟。

注意：

1、体积、特定于分析物的溶液和孵育时间是个体测试开发的一部分。

2、关于基因组扩增物的检测的基本步骤在第7页上解释：“PCR产物的测定性能”。一个扩增产物应该被生物素化，特异性杂交探针应该标记为FITC。第二个扩增产物应该标记有地高辛，特异性杂交探针应该标记为FITC。可以使用各种扩增方法（PCR或等温扩增，如LAMP或RPA）。

七、方法：

Milenia HybriDetect 2T是一种即用型通用试纸条（浸渍棒），基于使用金颗粒的侧流技术。该试纸条旨在开发用于同时检测两种不同分析物（如蛋白质、抗体或基因扩增）的定性或定量快速测试系统。用户需要开发两种特异性分析物溶液。溶液A：含有用FITC标记的第一探针（例如抗体、抗原、特异性探针）和用生物素标记的第二探针（例如抗体、引物）。溶液B：同样含有用FITC标记的第一探针（例如抗体、抗原、特异性探针）和用地高辛标记的第二探针（例如抗体、引物）（请参阅第5页的“通用测试原理”）。

待测样品与开发的分析物特异性溶液混合后，将试纸条放入该溶液中。

用FITC和生物素标记的分析物A复合物首先与试纸条的样品施加区域中标记有金的FITC特异性抗体结合。用FITC和地高辛标记的分析物B复合物也与试纸条的该区域结合。毛细力使金复合物A和B扩散到分析膜上。只有被捕获的金颗粒分析物在溢出相应测试带（测试带A-分析物A，测试带B-分析物B）时，与固定的生物素配体分子结合，并随时间生成红蓝色带状。未被捕获的金颗粒流过控制带，并被物种特异性抗体固定在那里。随着孵育时间的增加，会形成一个颜色浓烈的控制带。

八、测试原理 - 基因扩增物检测

HybriDetect 2T.png

测试原理 - 蛋白质检测

HybriDetect 2T-1.png

控制带试纸（Control Band Dipstick）

无论如何，控制带必须可见！

它是一个控制功能，不能用来评估测试带结果的质量。如果孵育期后控制带不可见，结果无效！必须使用新的试纸重复测试！

十、PCR产物测定性能

1. 从容器中取出所需数量的试纸条并标记它们。

2. 对于每个待分析的样品，将100 uL HybriDetect测定缓冲液或个别开发的缓冲液移液到反应管或微孔板的孔中。

HybriDetect 2T-3.png

3. 直接将5-10 uL的杂交产物移液到样品施加区域，或者选择将5-10 uL的杂交产物加入反应管/孔中的溶液中。

4. 将试纸条的样品施加区域放入溶液中，并以直立的姿势孵育，例如5-15分钟。

5. 孵育结束后，将试纸条从测定溶液中取出，并立即解读测试结果。

注意：

如果需要更高的分析灵敏度，增加PCR产物的体积可能会有所帮助。体积、特定于分析物的溶液和孵育时间始终是个别测试开发的一部分。

十一、测定性能 "RPA产物"

1. 从容器中取出所需数量的试纸条并标记它们。

2. 对于每个待分析的样品，将80 uL HybriDetect测定缓冲液（MGCBB）移液至反应管或微孔板的孔中。

3. 在RPA反应后，用HybriDetect测定缓冲液（MGCBB）稀释RPA反应混合物1/50或1/25（用于更高的灵敏度），并直接加载10 ul至样品施加区域。

4. 将已加载的试纸条的样品施加区域放入准备好的溶液中（参见第2点），并以直立姿势孵育，例如5-15分钟。

孵育结束后，将试纸条从测定溶液中取出，并解读测试结果。

十二、结果解读

应用内部PCR控制：

虽然生物素标记的扩增物A主要用于检测特定目标序列，但地高辛标记的扩增物B被提供作为内部PCR扩增控制。

HybriDetect 2T-4.png

检测线A	检测线B	质控线
阳性	阳性	阳性	1.控制带清晰可见，测试运行有效。 2.检测到扩增物A（阳性）。 3.内部PCR控制呈阳性（扩增物B）。
阴性	阳性	阳性	1.控制带清晰可见，测试运行有效。 2.未检测到扩增物A（阴性）。 3.内部PCR控制呈阳性（扩增物B）。
阳性	阴性	阴性	由于控制带未出现，测试运行无效。
阴性	阳性
阴性	阴性
阴性	阴性	阳性	1.快速测试正确执行，因为控制带清晰可见。 2.由于PCR扩增未成功，扩增物B无法检测到。
阳性	阴性	阳性	1.快速测试正确执行，因为控制带清晰可见。 2.由于PCR扩增未成功，扩增物B无法检测到。

十三、PCR故障排除

问题	可能的原因	建议
控制带不可见。	a) 测定缓冲液错误或被破坏 b) 浸渍条的过期日期已过 c) 浸渍条的存储条件错误	使用新的（新鲜的）化学试剂
试纸条上呈现阴性结果，但琼脂糖凝胶中的条带清晰可见。	a) 在琼脂糖凝胶中检测到非特异性PCR产物 b) 杂交不成功	通过Southern blotting或序列分析检查PCR产物的的一致性检查杂交条件。
矿物油	a) 矿物油影响测定的流动特性 b) 带状物的形成可能受阻。	非常缓慢地从反应管底部移除PCR产物。

十四、PCR测定的灵敏度

Milenia HybriDetect 2T的分析灵敏度相当于琼脂糖凝胶电泳和随后用溴化乙锭染色。不受PCR产物大小和扩增循环数的影响，可以检测到低至5 pg的DNA。

十五、文献参考

Dai T, et al, Frontiers in Microbiology (2019); 10:1884.

Yang Y, et al, Virology Journal (2017), 14(1), 1–10.

Qi Y, et al, PLoS ONE (2018), 13(11).

Ahmed F A, et al, Scientific Reports (2018), 8(1).

Wu L, Parasites & Vectors (2019). 12(1),

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