Hypoxyprobe：Hypoxyprobe-1 Kit

解析文章《Hypoxia is a potential risk factor for chronic in?ammation and adiponectin reduction in adipose tissue of ob/ob and dietary obese mice》

作者：

Jianping Ye, Zhanguo Gao, Jun Yin, and Qing HePennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, Baton Rouge, Louisiana

链接：https://journals.physiology.org/doi/full/10.1152/ajpendo.00435.2007

背景

肥胖已成为全球性的健康问题，它不仅影响个体的生活质量，还与多种代谢性疾病密切相关，如2型糖尿病和心血管疾病。在这些疾病中，慢性炎症和脂肪组织中脂联素（adiponectin）的减少起着重要作用。然而，肥胖导致这些变化的具体机制尚不完全清楚。本研究旨在探讨脂肪组织中的缺氧（hypoxia）是否可能是导致慢性炎症和脂联素减少的风险因素。

方法

实验动物与模型

研究采用了两种肥胖模型：一种是基因型肥胖模型（ob/ob小鼠），另一种是饮食诱导的肥胖模型（给予高脂饮食的C57BL/6小鼠）。通过测量脂肪组织中的间质氧分压（P_O_2）、缺氧探针信号以及缺氧反应基因的表达，验证了脂肪组织中的缺氧状态。

细胞培养与处理

为了进一步研究缺氧对脂肪细胞和巨噬细胞的影响，从瘦鼠的脂肪组织中分离出原代脂肪细胞和巨噬细胞，并在体外进行缺氧处理（1%氧气浓度）。此外，还使用了3T3-L1脂肪细胞和NIH3T3成纤维细胞系进行缺氧处理，并观察了缺氧对炎症基因和脂联素表达的影响。

缺氧检测

研究使用了Hypoxyprobe Inc品牌的Hypoxyprobe-1 Kit试剂盒（货号：HP2-100）来检测脂肪组织中的缺氧状态。该试剂盒包含三种关键试剂：匹莫尼唑盐酸盐（pimonidazole hydrochloride，Hypoxyprobe-1）、与异硫氰酸荧光素（FITC）结合的缺氧探针抗体以及与辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗FITC二抗。缺氧探针在缺氧条件下与蛋白质结合，形成稳定的加合物，这些加合物可以通过免疫化学方法进行检测。

缺氧探针注射与收集：在缺氧探针注射后30分钟收集脂肪组织样本，用于Western blotting和免疫组化染色。

Western blotting：将新鲜组织冷冻并制备成全细胞裂解液，通过SDS-PAGE凝胶电泳和Western blotting检测缺氧探针信号。

免疫组化染色：将新鲜脂肪组织固定、脱水并嵌入石蜡中，然后使用缺氧探针抗体进行免疫组化染色，观察缺氧探针在脂肪组织中的分布。

基因表达分析

通过实时定量RT-PCR（qRT-PCR）检测脂肪组织中缺氧反应基因（如HIF-1α、VEGF、GLUT1、Hemox和PDK1）和炎症相关基因（如TNF-α、IL-1、IL-6、MIF、TGF-β和MMP9）的mRNA表达水平。同时，还检测了脂联素的mRNA和蛋白表达水平。

转录因子活性分析

使用荧光素酶报告基因系统检测缺氧对NF-κB和TNF-α基因启动子活性的影响。通过电穿孔或脂质体转染将报告质粒转入3T3-L1脂肪细胞和NIH3T3成纤维细胞，并在缺氧处理后检测荧光素酶活性。

实验结果

脂肪组织中的缺氧状态

在ob/ob小鼠和饮食诱导的肥胖小鼠中，脂肪组织的间质氧分压显著降低，缺氧探针信号增加，缺氧反应基因表达上调。这些结果表明，肥胖小鼠的脂肪组织中存在明显的缺氧状态。

缺氧与炎症的关系

在肥胖小鼠的脂肪组织中，炎症相关基因的mRNA表达水平显著增加。在体外实验中，缺氧处理能够诱导原代脂肪细胞和巨噬细胞中炎症基因的表达。此外，缺氧还能够激活NF-κB转录因子和TNF-α基因启动子，进一步证实了缺氧在诱导炎症反应中的作用。

缺氧对脂联素表达的影响

在肥胖小鼠的脂肪组织中，脂联素的mRNA和蛋白表达水平显著降低。在体外实验中，缺氧处理能够抑制3T3-L1脂肪细胞中脂联素的mRNA表达，并抑制脂联素基因启动子的活性。这些结果表明，缺氧可能是导致脂联素减少的一个重要因素。

结论

本研究表明，肥胖导致的脂肪组织缺氧可能是引发慢性炎症和脂联素减少的风险因素。缺氧能够激活炎症反应并抑制脂联素的表达，从而可能对肥胖相关的代谢性疾病的发展产生重要影响。这些发现为理解肥胖及其相关代谢性疾病的发病机制提供了新的视角，并为未来的治疗策略提供了潜在的靶点。

Hypoxyprobe-1 Kit试剂盒的作用和价值

产品链接：细胞和组织缺氧的免疫化学检测，包括免疫荧光、免疫过氧化物酶或流式细胞。

http://site.hypoxyprobe.com/knowledge-center-articles/HP2-Hypoxyprobe-Plus-Kit-Insert-2023.pdf

作用

Hypoxyprobe-1 Kit试剂盒在本研究中发挥了关键作用，它通过检测缺氧条件下形成的蛋白质加合物来定量评估组织中的缺氧状态。该试剂盒具有高敏感性和特异性，能够准确反映组织中的缺氧程度，为研究缺氧在疾病发生和发展中的作用提供了有力的工具。

价值

科学研究的重要工具：Hypoxyprobe-1 Kit试剂盒为研究缺氧在生物学和医学领域中的作用提供了重要的技术手段。它可以帮助科学家们更深入地了解缺氧在细胞代谢、炎症反应、肿瘤发展等方面的作用机制。

疾病诊断和治疗的辅助手段：通过检测组织中的缺氧状态，医生可以更好地评估患者的病情和发展趋势，从而制定更加个性化和有效的治疗方案。此外，该试剂盒还可以用于监测治疗效果和预测疾病预后。

推动新药研发：缺氧是多种疾病的重要病理生理特征之一，因此针对缺氧途径的新药研发具有重要意义。Hypoxyprobe-1 Kit试剂盒可以为新药筛选和药效评价提供有力的支持，加速新药研发的进程。

综上所述，Hypoxyprobe-1 Kit试剂盒在生物学和医学研究中具有重要的应用价值，它为我们深入了解缺氧在疾病发生和发展中的作用提供了新的视角和手段。