Advanced BioMatrix：HyStem-HP水凝胶

骨再生是骨科学领域的重要研究课题之一，尤其是在处理大面积骨缺损时，如何有效促进骨再生是当前临床治疗的难点。研究表明，细胞间通讯在骨再生过程中扮演着重要角色，而细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为细胞间通讯的重要媒介，近年来受到了广泛关注。EVs包括外泌体、微泡等多种类型，能够携带生物活性分子（如蛋白质、mRNA和miRNA）在细胞间传递信息，调节细胞功能。EVs作为一种新型的生物活性分子载体，在细胞间通讯、组织稳态和再生过程中发挥着重要作用。已有研究表明，EVs能够促进多种组织的再生，如肝细胞和心肌细胞等。然而，关于EVs在骨组织再生中的作用机制尚不明确。

“Bone marrow stromal/stem cell-derived extracellular vesicles regulate osteoblast activity and differentiation in vitro and promote bone regeneration in vivo”旨在探索骨髓基质干细胞（Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs）来源的EVs对成骨细胞活性和分化的调控作用，并探讨其在体内促进骨再生的潜能。

EV输送系统改善了骨骼修复：手术后0至8周活体小鼠的微型CT扫描。EV组是右侧缺陷，凝胶组是左侧缺陷。

实验方法

1. 细胞培养和EVs的提取

从健康捐赠者的骨髓中分离并培养BMSCs。

收集BMSCs培养上清液，通过梯度超速离心法提取EVs。

通过透射电镜和流式细胞术验证EVs的形态和表面标记物。

2. 成骨细胞分化实验

体外实验：将提取的EVs加入成骨细胞培养基中，通过Alizarin Red染色观察钙沉积情况，以及通过qPCR和Western Blot检测成骨相关基因（如RUNX2、ALP、OCN、OPN）的表达水平。

细胞周期和增殖分析：通过流式细胞术（FACS）和MTT实验分析EVs对成骨细胞增殖的影响。

3. microRNA测序和功能验证

microRNA测序：通过RNA测序技术比较BMSCs和EVs中microRNA的表达谱，发现miR-196a、miR-27a和miR-206在EVs中高度富集。

功能验证：将miR-196a、miR-27a和miR-206的模拟物（mimics）和抑制剂分别转染成骨细胞，观察其对成骨分化的影响。

4. 动物实验

模型建立：在SD大鼠颅骨上制造直径为5mm的临界尺寸骨缺损，实验组填充含EVs的水凝胶，对照组仅填充水凝胶。

评估方法：通过micro-CT扫描、组织学和免疫组化染色评估新骨形成情况。

实验结果

1. EVs的提取和鉴定

电镜观察：EVs呈典型的杯状结构，直径在30-100 nm之间。

流式细胞术：EVs表达典型的EVs标记物CD63。

2. EVs对成骨细胞分化的影响

体外实验：EVs处理组成骨细胞钙沉积显著增加，成骨相关基因表达上调。

细胞增殖分析：EVs对成骨细胞增殖的影响较小，主要促进成骨分化。

3. microRNA在EVs中的作用

测序结果：miR-196a、miR-27a和miR-206在EVs中高度富集。

功能验证：miR-196a在促进成骨分化方面作用最为显著，其抑制剂可部分逆转EVs的成骨分化效应。

4. 动物实验结果

micro-CT扫描：实验组新骨形成显著多于对照组。

组织学染色：HE和Masson染色显示实验组骨缺损区域新骨形成良好，骨小梁结构完整。

在本研究的体内实验中，HyStem-HP水凝胶（#GS314F #GS315F#GS1006F，巯基修饰透明质酸，明胶和肝素水凝胶试剂盒）作为EVs的载体被成功应用于颅骨缺损模型中。HyStem-HP水凝胶具有良好的生物相容性和可降解性，能够为EVs提供一个稳定的释放环境，延长其在缺损部位的滞留时间，从而提高EVs的生物利用度和治疗效果。此外，HyStem-HP水凝胶还能够促进细胞的黏附和增殖，进一步增强骨再生的效果。因此，HyStem-HP水凝胶在本研究中作为EVs的载体，对于实现EVs在体内的有效释放和骨再生的促进具有重要作用和价值。

实验总结

本研究通过体内外实验发现，BMSCs来源的EVs能够显著促进成骨细胞的分化和骨再生。具体来说，EVs中的miR-196a在调节成骨细胞分化和成骨相关基因表达中发挥了关键作用。体内实验结果表明，含有EVs的HyStem-HP水凝胶显著促进了颅骨缺损处的骨再生，与未含EVs的水凝胶相比，表现出更高的骨密度和骨量。