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FuGENE:FuGene 6 (货号#F6-1000)转染试剂

发布者:艾美捷科技    发布时间:2024-09-03     
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腺病毒是一种无包膜的双链DNA病毒,其病毒颗粒呈二十面体结构,包含内核和外层衣壳。这类病毒能导致人类常见的上呼吸道感染,如普通感冒、结膜炎和腹泻等。在腺病毒的基因组中,E4 ORF3是一个重要的早期基因,它编码的蛋白质E4 11k在病毒复制周期中起着至关重要的作用。E4 11k蛋白的主要功能是改变宿主细胞的环境,以促进病毒复制并抑制宿主细胞的蛋白质合成。具体而言,E4 11k能够结合位于Pprocessingbodies, P-bodies)中的细胞蛋白Ddx6,并破坏其定位。P体是细胞质中的颗粒状结构,包含被抑制的mRNA和与mRNA降解相关的蛋白质。这种结合可能通过影响宿主细胞的mRNA降解机制,间接促进病毒基因的表达和复制。


“The Binding Site Between the Adenoviral Protein E4 11k and the Cellular Protein Ddx6目的是确定E4 11k与Ddx6的结合位点,并探讨这一相互作用对病毒生命周期的影响。这不仅有助于我们深入理解腺病毒的致病机制,还可能为抗病毒药物的研发提供新的靶点。

FuGene 6.png

 

转染方案: 将FuGene6和质粒DNA按不同比例混合。在室温下孵育5-10分钟,然后加入到细胞培养板中。在37?C下孵育24小时。

 

实验方法

1. 细胞培养与转染

细胞系:本研究采用HeLa细胞系,这是一种常用于病毒学研究的细胞系。HeLa细胞在含有15%小牛血清的培养基中生长。

转染方法:为了研究E4 11k与Ddx6的相互作用,研究人员首先需要将E4 ORF3基因(编码E4 11k)导入HeLa细胞中。他们使用FuGene 6 (货号#F6-1000)转染试剂,这是一种商业化的转染试剂,能够提高转染效率。

转染过程:将FuGene 6与E4 ORF3表达质粒(带有HA标签)按不同比例混合,形成转染复合物。这些复合物被添加到细胞培养板中,并在37°C下孵育24小时。


2. 免疫印迹(Immunoblot)分析

样品制备:转染后,通过裂解细胞并提取蛋白质样品。使用RIPA缓冲液裂解细胞,并通过SDS-PAGE将蛋白质根据分子量进行分离。

免疫检测:将蛋白质转移到膜上,并使用针对特定蛋白质的抗体进行探测。在本研究中,使用了针对gamma-tubulin(作为内参)和HA标签(识别E4 11k)的抗体。通过红外偶联的二抗和LICOR Odyssey机器进行可视化。


3. 转染效率优化

由于初次转染尝试未能成功检测到E4 11k的表达,研究人员对转染条件进行了多次优化。他们调整了FuGene 6与质粒DNA的比例,增加了质粒DNA的用量,并降低了二抗的稀释度。然而,即使在最佳条件下,仍未能稳定地检测到E4 11k的表达。


FUGENE6转染试剂的作用与价值

FuGene6在本研究中扮演了至关重要的角色,它作为一种高效的转染试剂,显著提高了E4 ORF3表达质粒在HeLa细胞中的转染效率。

提高转染效率:相比其他转染方法,如磷酸钙共沉淀法或电穿孔法,FuGene 6能够更有效地将外源基因导入细胞内。这使得研究人员能够在更短的时间内获得足够的转染细胞,从而加速了实验进程。

降低细胞毒性:FuGene 6对细胞的毒性相对较小,即使在较高的浓度下使用,也不会对细胞造成显著的损伤。这保证了转染后的细胞能够保持正常的生理功能,从而更准确地反映外源基因的表达情况。

简化操作步骤:FuGene 6的使用相对简单,只需将试剂与质粒DNA混合后直接加入细胞培养板中即可。这大大简化了转染操作的步骤,降低了实验难度


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