Enzo：PROTEOSTAT Protein aggregation assay

标题 ：Amyloid-like RIP1/RIP3 RHIM Fragments’ Characterization and Application as a Drug Depot"，由 Maytham Ismail 和 Mathumai Kanapathipillai 

DOI : https://doi.org/10.3390/molecules28031480

摘要：

本文研究了受体相互作用蛋白激酶 1 和 3（RIP1/RIP3）在细胞坏死过程中形成的聚集体。尽管已有研究关注了全长激酶蛋白的聚集，但关于 RIP1/RIP3 的小肽序列的聚集潜力、物理化学特性以及生物医学应用潜力尚未被探索。本研究调查了 RIP1/RIP3 蛋白 RHIM 区域的四肽和十二肽序列的聚集倾向，这些序列已知可驱动 β-折叠片的形成和随后的聚集。研究了聚集动力学、物理化学特性、机械敏感性特性、细胞效应以及作为抗癌药物库的潜力。结果表明，氨基酸的数量和浓度在类淀粉样聚集体的属性中起作用。此外，当与顺铂（cisplatin）配伍时，聚集体对肺癌细胞的毒性显著高于等量的顺铂，无论是否使用超声波。本研究为进一步探索 RIP1/RIP3 肽和蛋白聚集体在多种细胞功能和疾病中的作用以及作为药物库的潜力提供了平台。

研究背景：

1.淀粉样聚集的重要性：淀粉样聚集体在疾病和正常生理功能中扮演重要角色。例如，受体相互作用蛋白激酶1和3（RIP1/RIP3）的聚集体在细胞坏死过程中是正常的蛋白质聚集例子。

2.蛋白质聚集的双面性：传统上，蛋白质聚集被视为病理过程，与多种神经退行性疾病有关。然而，近期研究发现，一些蛋白质聚集体对正常细胞过程有积极作用，如促进坏死、支持记忆、抗菌反应、储存和支架作用。

3.RIP1/RIP3蛋白的研究：RIP1/RIP3蛋白形成的淀粉样信号复合体对坏死过程至关重要。尽管已有研究关注了全长激酶蛋白的聚集，但RIP1/RIP3的小肽序列的聚集潜力及其在生物医学应用中的潜力尚未被充分探索。

实验设计：

1.肽段选择：研究者选择了RIP1和RIP3蛋白中的RHIM区域的四肽和十二肽序列，这些序列已知能够驱动β-折叠片的形成和随后的聚集。

2.聚集特性研究：通过测定聚集动力学、物理化学特性、机械敏感性特性、细胞效应，研究者评估了这些肽段的聚集倾向和特性。

3.药物载体的潜力：研究者探讨了这些聚集体作为抗癌药物载体的潜力，特别是与顺铂（cisplatin）结合使用时对肺癌细胞的毒性。

实验方法：

使用Thioflavin T (ThT)和浊度测量来评估聚集;利用Proteostat分析和透射电子显微镜（TEM）来表征聚集体。通过流式细胞仪测量细胞对聚集体的摄取；对正常细胞的毒性和活性氧（ROS）水平进行测试，以评估聚集体的安全性；使用LDH细胞毒性实验来评估顺铂和聚集体包裹顺铂的毒性效果。

研究内容：

1.研究了 RIP1 和 RIP3 蛋白 RHIM 区域的短肽序列的聚集特性，聚集体的物理化学特性和机械敏感性及聚集体对细胞的影响以及作为抗癌药物库的潜力。

2.使用顺铂作为模型抗癌药物，研究了肽聚集体/顺铂配方对肺癌细胞的影响，发现四肽序列（IQIG, VQVG）未显示出显著聚集，十二肽序列（TIYNSTGIQIGA, NIYNCSGVQVGD）在 100 ?M 以上浓度时表现出显著聚集特性。

3.聚集体的尺寸可以通过超声波介导的破碎来调节，聚集体在与顺铂配伍时对肺癌细胞显示出显著毒性，表明它们作为药物载体的潜力。

4.结论：研究为进一步探索 RIP1 和 RIP3 肽和蛋白聚集体在体外和体内的聚集特性及其在治疗疾病中的潜在应用铺平了道路。

研究意义：

这项研究为进一步探索RIP1/RIP3肽和蛋白聚集体在多种细胞功能和疾病中的作用，以及它们作为药物载体的潜力提供了基础。研究结果可能有助于开发新的生物医学应用，特别是在药物传递系统方面。

PROTEOSTAT Protein aggregation assay在文献中的主要作用：

艾美捷货号：ENZ-51023-KP050、ENZ-51023-KP002

在这篇文献中，PROTEOSTAT Protein aggregation assay 被用作一种商业化的蛋白质聚集检测方法。这个方法原则上与硫黄素T（Thioflavin T, ThT）结合类似，ThT是一种已知的可以与淀粉样结构结合并发出荧光的染料，常用于检测和定量蛋白质聚集。然而，PROTEOSTAT assay提供了一种不同的技术手段来评估蛋白质的聚集状态。

在研究中，作者使用PROTEOSTAT assay来进一步确认他们观察到的RIP1和RIP3蛋白短肽序列的聚集特性。具体来说，研究中比较了肽聚集体和单体与已知的溶菌酶（lysozyme）聚集体和单体的对比，以此来评估短肽（4个氨基酸残基）和长肽（12个氨基酸残基）的聚集倾向。结果表明，短肽表现出与单体类似的特征，没有明显的聚集；而长肽则显示出与聚集体类似的散射特征，表明它们确实发生了聚集。

使用PROTEOSTAT assay的好处是，它提供了一种快速、灵敏且可量化的方法来评估蛋白质聚集，这对于理解蛋白质行为和它们在疾病及正常生理功能中的作用至关重要。在这项研究中，PROTEOSTAT assay与ThT和浊度测量结果一致，进一步验证了作者关于RIP1/RIP3肽段聚集特性的发现。

PROTEOSTAT Protein aggregation assay 在其他类型的蛋白质研究中的主要应用：

PROTEOSTAT Protein aggregation assay 是一种用于检测蛋白质聚集的商业化工具，它可以应用于多种类型的蛋白质研究，尤其是在研究蛋白质错误折叠、聚集以及相关疾病方面非常有用。以下是一些具体的应用领域：

1.神经退行性疾病研究：在如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病等神经退行性疾病中，特定的蛋白质（如β-淀粉样蛋白、α-突触核蛋白和亨廷顿蛋白）会形成聚集体，PROTEOSTAT assay可以用来定量这些聚集体。

2.药物开发：在药物筛选过程中，可以使用PROTEOSTAT assay来评估潜在药物对蛋白质聚集的影响，尤其是在寻找可以防止或解散聚集体的化合物时。

3.蛋白质工程：在设计新型蛋白质或肽类治疗剂时，研究人员可能会使用PROTEOSTAT assay来评估设计的蛋白质是否倾向于形成聚集体，这对于提高药物的稳定性和安全性至关重要。

4.细胞应激反应：在研究细胞对各种应激条件（如氧化应激、热休克等）的反应时，PROTEOSTAT assay可以用来监测应激诱导的蛋白质聚集。

5.蛋白质质量控制：在生物制药行业，PROTEOSTAT assay可以用于检测生产过程中蛋白质聚集体的形成，以确保最终产品的纯度和效力。

6.疾病机理研究：在研究特定疾病中蛋白质聚集如何导致病理变化时，PROTEOSTAT assay可以提供关于聚集过程的定量信息。

7.功能性蛋白质聚集：在某些情况下，蛋白质聚集是功能性的，例如在细胞信号传导中。PROTEOSTAT assay可以帮助区分功能性和病理性聚集。

8.蛋白质稳定性研究：在研究蛋白质如何在不同的环境条件下保持稳定时，PROTEOSTAT assay可以用来监测蛋白质聚集作为不稳定性指标。

9.生物标志物开发：在寻找与蛋白质聚集相关的疾病生物标志物时，PROTEOSTAT assay可以作为筛选和验证潜在生物标志物的工具。

10.细胞模型和动物模型研究：在细胞培养或动物模型中研究蛋白质聚集相关的疾病时，PROTEOSTAT assay可以用于评估模型的有效性和病理状态。