Advanced BioMatrix：细胞外基质（ECM）蛋白筛选试剂盒

活体组织可以被视为由细胞和液体构成的动态网状结构。尽管组织中的细胞彼此非常接近，但它们并不是简单地紧密缠绕在一起的。相反，它们在细胞外网状结构的帮助下被间隔开来。细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）是一种动态的三维大分子网络，为细胞和组织提供结构支持。细胞外基质不仅填充着细胞之间的空间，还通过与细胞表面的受体相互作用，调节细胞的功能和行为，如细胞迁移、细胞黏附、信号传导和组织修复。在细胞外基质中，蛋白质是重要的组成部分之一。它们可以形成纤维蛋白网络，提供支持和机械强度，使细胞能够维持其结构。此外，蛋白质还可以通过与其他细胞外分子和受体相互作用，参与信号传导和细胞间的相互作用。细胞外基质由三类主要生物分子组成：

1. 结构蛋白：例如胶原蛋白（collagen）、弹性蛋白（elastin）。

2. 非结构蛋白：例如纤维连接蛋白(fibronectin)、各种层粘连蛋白(laminin)和各种整合蛋白(integrin)。

3. 蛋白聚糖：这些蛋白由一个蛋白质核心组成，长链重复的二糖单元（称为糖氨基聚糖，GAG）附着在上面，形成ECM极其复杂的高分子量组分。

细胞外基质蛋白种类多样，不同蛋白间还可以互相组合为体外细胞培养创造有利条件。但是也正是因为这种多样性，也为体外培养细胞选择合适的细胞外基质蛋白带来巨大挑战。作为2D/3D细胞培养专家，Advanced BioMatrix为您带来 ECM Select?Array试剂盒，允许您在36种ECM蛋白组合上培养细胞，帮助您找到适合您细胞的细胞外基质(ECM)蛋白。

实验流程：

1. 将细胞接种到载玻片上

1.1在5ml完整的培养基中准备250000个所需细胞(50,000个细胞/毫升)。

1.2从-20℃的冰箱中取出ECM Select? Array Kit Ultra-36，并放置在无菌层流罩下。打开铝箔袋并取出其中的组分。首先，从塑料袋中取出细胞培养板，并取下盖子。然后打开载玻片支架上的盖子，轻轻取出载玻片。将载玻片放入细胞培养板的一个小隔间中。在取出载玻片时要小心，使用无菌技术，如戴无菌手套或使用无菌镊子，并只触摸载玻片的边缘。确保印刷的斑点面朝上（载玻片上的数字和字母应清晰可见）。

1.3在载玻片上加入5ml无菌PBS。确保整个载玻片浸泡在PBS溶液中，避免在载玻片下方困住气泡。轻轻摇动载玻片几次，然后吸出PBS溶液。注意：不要触摸载玻片表面。

1.4加入5ml所需的培养基（用于细胞培养的相同培养基），确保整个载玻片浸泡在培养基中。轻轻摇动载玻片几次，然后吸出培养基溶液。注意：不要触摸载玻片表面。

1.5 通过轻轻上下移液混合准备好的25万个细胞，然后立即将细胞直接加到载玻片上。在向载玻片上分配细胞时，同时来回移动移液管，均匀分布细胞。注意：不要触摸载玻片表面。将盖子放回培养皿上。

1.6小心地将含有载玻片的4孔板转移到孵育箱中，在37℃、5% CO2条件下过夜培养细胞（至少12小时，以确保细胞有效附着，最长可达3天）。

注意：从载玻片支架上取下载玻片时，载玻片表面可能可见阵列斑点。用PBS/培养基洗涤后，这些斑点可能会消失。这是正常现象，不会影响ECM阵列的性能。

注意：对于细胞系，12小时应足以看到细胞附着。对于新鲜从组织中分离出的细胞或之前被冷冻的细胞，可能需要最多2天才能看到明显的细胞附着。

注意：如果需要进行细胞增殖研究，请减少细胞数量，以便在斑点上留出额外空间供细胞分裂。建议根据细胞的大小和形态，从10万到15万个细胞开始。细胞越大，所需的细胞数量就越少。

2. 在载玻片上清洗和观察细胞

2.1经过至少12小时的孵育后，从培养箱中取出培养板，将培养板放在相差显微镜下观察，从5倍物镜开始。轻轻来回移动培养板，区分非粘附的漂浮细胞和附着细胞。
注意：由于ECM Select?载玻片上的水凝胶表面具有不易粘附的特性，细胞会优先附着到打印有适当细胞外基质的斑点上。细胞被限制在斑点内。

2.2吸去非粘附的漂浮细胞，确保不扰动载玻片表面。每次用5ml培养基洗涤载玻片两次，然后将载玻片留在5ml培养基中。

2.3在相差显微镜下观察每个斑点块的细胞附着情况。每个块代表一个具有9个复制点的唯一ECM。

2.4在这个阶段，细胞可以固定，也可以在载玻片上再培养3天。

3. 在载玻片上固定细胞

3.1通过吸去培养基，去除载玻片上的培养细胞。用含Ca2+和Mg2+的冷1倍Hank's平衡盐溶液（HBSS）两次洗涤载玻片上的细胞，每次用5ml。

3.2通过在1倍PBS溶液中加入4%的冷聚甲醛（PFA）来固定载玻片上的细胞。将载玻片放入4℃的PFA溶液中5分钟，然后在室温下额外固定10分钟。

3.3去除PFA溶液，然后用1倍HBSS溶液每次洗涤载玻片两次，每次用5ml。载玻片可以存放在4℃的1倍HBSS溶液中以备将来染色，或者可以立即处理。

4. 在载玻片上进行细胞核和免疫染色

4.1可以使用许多可用的核染色试剂对载玻片上的细胞进行染色，如DAPI、PoPo-3、DraQ等。

4.2对于特定抗体染色，请按照制造商的说明进行免疫细胞化学稀释建议。

4.3完成染色后，用5ml细胞培养水每次洗涤载玻片两次，每次5分钟。然后将载玻片从培养皿中取出，放在暗处的架子上晾干。

4.4载玻片可以直接放入荧光显微镜中观察。

注意：不要使用任何封片介质，如Vectashield。

注意：不要使用倒置位置进行观察，这通常用于油镜头。

ECM Select? Array Kit单个条件(9个复制点)的细胞附着示例。左图为mcf7细胞。右图为人肝细胞。图像是在Leica DMIL显微镜系统的5倍物镜上拍摄的。

文献案例：

为了更好地了解血管肉瘤在体外生长条件，该团队专注于它们培养中的一个特定方面——与细胞外基质的粘附，以便确定可能促进和/或增强它们在组织培养中生长的附着基质。数据表明，血管肉瘤的细胞外基质含有与非疾病内皮细胞相似的蛋白质组成。利用Advanced BioMatrix的ECM Select? Array Kit试剂盒，判断血管肉瘤细胞系对不同细胞外基质蛋白的附着情况，血管肉瘤细胞系对胶原I或纤维连接蛋白等基质表现出强烈的附着偏好，对胶原IV、层粘蛋白或原弹性蛋白的偏好较少。在优选的细胞外基质基质上生长促进了血管肉瘤细胞系的有丝分裂信号传导，并增加了它们的增殖。这些发现提供了洞察力，可能有助于更成功地在体外培养血管肉瘤细胞系。

哺乳动物细胞存在于体内独特的微环境中，影响它们的行为（增殖、分化、死亡等）和功能。当细胞在体外培养时，有必要重现这种微环境，以实现生理相关的生长。在影响细胞在体内行为的许多因素中，细胞外基质（ECM）在确定细胞功能方面发挥着重要作用。目前，找到适合细胞培养的合适的ECM是一个需要大量细胞、以及显著的时间和成本投入的试错过程。ECM Select? Array Kit Ultra-36允许在短时间内用少量细胞并行筛选36种ECM及其组合。

美国Advanced BioMatrix是3D组织培养、细胞检测和细胞增殖等领域实验解决方案的佼佼者，在分离、纯化、冻干、细胞培养和蛋白检测、多肽粘附、附着因子、基质硬度和其他3D matrix 产品开发方面有着丰富的经验。

产品竞争优势：

1. 提供高纯度和成分确定的胞外基质；

2. 超过1000余篇文献引用PureCol 胶原产品，品质非常均一；

3. 在3D培养基领域可提供全面的产品线；

4. 唯1可提供特异性刚性有机硅基板的公司（CytoSoft）;

5. 唯1可提供可溶性丝纤蛋白的供应商（可运用于多种3D培养）；

6. 如果客户首次接触3D胶原凝胶，Advanced BioMatrix还是唯1的预制胶原蛋白(PureCol EZ gel)供应商。