Biogradetech：FlyCut DNA Assembly Mix Plus 快速多片段DNA无缝克隆预混液

传统的DNA克隆方法主要采用限制性酶切与连接的方法，通过使用限制性内切酶切割目标DNA片段和克隆载体，然后使用DNA连接酶将两者连接起来。但是这种方法存在很多缺陷，如果目标DNA片段或克隆载体缺乏适合的酶切位点，就需要进行额外引入适当的序列或使用其他限制性内切酶，费时费力，过程繁冗，而且限制性酶切与连接方法的连接效率和精确性可能受到多种因素的影响，如酶切位点的完整性、连接酶的效能和条件、连接反应的温度和时间等。众多因素都可能导致连接产物的多样性和不确定性。 

基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，可以有效克服限制性酶切与连接的缺点，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。

 Biogradetech的FlyCut? DNA Assembly Mix Plus无缝克隆预混液，一次反应可完成单至多个 DNA 片段的重组，最快仅需 5分钟即可完成单片段重组，且阳性率高于95%。预混液中添加的辅助因子，有效提高克隆阳性率；经优化的反应体系，能够一定程度上耐受未纯化 PCR 产物中含有的杂质。升级版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

多片段DNA无缝克隆流程

1.线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点，对载体进行线性化，载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成。 

1.1酶切制备：一些限制性内切酶不能有效地消化超螺旋 DNA，因此可能会留下不同数量的未切割载体 DNA，降低阳性率。推荐使用 FlyCut?快速内切酶进行酶切（单酶切或者双酶切），使载体线性化完全，以降低转化背景（未切割的载体转化获得的假阳性克隆） 

1.2反向 PCR扩增制备：为减少扩增突变的引入，推荐使用高保真 PCR Mix 进行扩增。推 荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

2.插入片段PCR引物设计

PCR 引物的5'端必须包含与其相邻片段（插入片段或载体）末端同源的15~25 nt（推荐18 nt）序列。假如载体为粘性末端，且3' 端突出，则引物设计必须包含突出部分；若5'端突出，则引物设计可以包含突出部分，也可以不包含。 

插入片段正向扩增引物：5'-上游载体末端同源序列+酶切位点（可选）+基因特异性正向扩增序列- 3' 

插入片段反向扩增引物：3'-基因特异性反向扩增序列+酶切位点（可选）+下游载体末端同源序列-5'  

本产品中所提供的pUC19载体（Ampr）连接端序列如下：

3.插入片段的 PCR 扩增

推荐使用高保真PCR 预混液进行扩增，以减少扩增突变的引入。

建议使用纯化后的 PCR 产物进行无缝克隆反应，若PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物，可直接使用，但加样体积不应超过总反应体积的20%。  

4.重组反应

4.1于冰水浴中配置以下反应体系：

（a）最适载体用量 (ng) = 0.02 ×载体碱基对数，即03 pmol。

（b）插入单片段，最适片段用量（ng）= 0.04 ×片段碱基对数；插入多片段，每片段最适用量（ng）= 0.02 ×片段碱基对数。 

重组反应体系配制完成后，用移液枪轻轻吸打混匀各组分，避免 产生气泡，切勿涡旋。 

4.2将反应体系置于 50℃，反应 5~60 min。 

4.3将反应液离心管置于冰上冷却，之后进行转化或者储存于 -20℃。  

5.重组产物转化

取 5~10ul反应液，加入到100ul感受态细胞中，缓慢吸打混匀，冰上放置 30 min。42℃热激 45~60 sec，冰浴5 min。加500ul SOC或LB培养基，37℃ 振荡培养40~60 min（200 rpm）。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上，倒置于37℃过夜培养。  

6.阳性克隆检测

挑取单菌落至10ul ddH2O中混匀，95℃裂解10min后，取1ul裂解液作为模板，进行菌落PCR鉴定，或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后，提取质粒进行酶切鉴定。阳性对照的阳性克隆检测，菌落PCR引物使用通用引物M13F与M13R，酶切鉴定用HindIII与EcoRI。

M13F：TGTAAAACGACGGCCAGT M13R：CAGGAAACAGCTATGAC   

Biogradetech生命科学和医药研发行业关键原料与试剂的供应商：Biogradetech成立于2015年，总部位于美国加利福尼亚州，早期以产品技术研发服务起家，逐步发展了广泛的产品线，并将其商业化销售，包括蛋白质、抗体、酶、培养基、试剂盒和仪器。适用于细胞生物学、蛋白质组学、分子生物学、免疫学、微生物学、诊断学、生物化学、神经科学、血液分析和高通量药物筛选等领域。