Biogradetech：T细胞分选激活磁珠，CD3/CD28抗体偶联磁珠

几十年来，已经建立了许多体外刺激T细胞的方法，从不太特异的PHA促生物素，到更具针对性的抗CD3单克隆抗体，再到抗体包被的磁珠。其中大多数利用了T细胞生物学的优势，主要针对T细胞受体（TCR）的结合，启动足够的细胞内信号转导，推动有效的激活、增殖和分化。反过来，激活T细胞在基础研究和临床环境中具有多种用途。对激活T细胞的研究有助于详细了解生物学现象，如免疫应答的启动、细胞内信号传导、胸腺细胞发育和T细胞记忆形成，以及T细胞功能障碍或衰竭。刺激不仅允许免疫细胞的长期培养，包括选择和扩增单个细胞克隆，还可以提高基因修饰方法的效率。因此，T细胞激活也是基因工程T细胞制造过程中的一步，可实现高效的编辑和非克隆性扩增至临床意义的剂量，选择适当的T细胞刺激试剂以诱导足够的T细胞反应非常重要。 

现今典型的T细胞的刺激方法是基于至少双价抗CD3和抗CD28抗体的刺激。多价结合是必要的，因为仅结合TCR（定义为信号1）不会引起完全的T细胞激活，而是导致非响应状态。因此，除了TCR外，共刺激受体，尤其是CD28，必须提供支持性信号（称为信号2）。CD28介导的共刺激与TCR信号协同作用，促进细胞存活、克隆扩增和分化。  

Biogradetech人的T激活剂CD3/CD28由与人CD3和CD28抗体包被的4.5um磁珠组成，为人的T细胞的分离和扩增提供了简单有效的方法。首先，该激活剂能够轻松地从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离和浓缩CD3+ T细胞。在分离后，磁珠上的抗CD3和抗CD28抗体的共价结合提供了调节T细胞激活和扩增所需的初级和共刺激信号。在细胞扩增过程中，细胞培养需要额外添加其他细胞因子，如人IL-2、IL-7和IL-15，以更高效地激活细胞。经过10-13天的培养期，激活的细胞可以扩增1000倍。

实验步骤（简易汉化，请务必以英文原版说明书为准）：

1. 清洗T激活剂CD3/CD28抗体偶联磁珠：

1.1将人T激活剂CD3/CD28磁珠悬浮于管中（涡旋离心30秒以上，或倾斜和旋转5分钟）。 

1.2将珠子转移到容器中。

1.3 加入等体积的PBS（含1% HSA）。如果珠子体积小于1mL，添加1mL含有1% HSA的PBS进行悬浮。 

1.4将管子放在磁铁上1分钟，然后弃掉上清液。 1.5将管子从磁铁上取下，然后用相同体积的PBS（含1% HSA）重新悬浮珠子。  

2. 分离CD3+ T细胞：

2.1对于Ficoll分离的PBMCs，轻轻将细胞悬浮在PBS（含1% HSA）中，并将细胞密度调整为2-5×107个细胞/毫升。注意，细胞的总数不应超过2×108个细胞/毫升。 

注意：在开始之前，通过流式细胞术确定样品中CD3+ T细胞的百分比。 

2.2将洗涤的珠子与PBMCs以3（珠子）：1（CD3+ T细胞）的比例加入，如果细胞是纯分离的T细胞，则将珠子与细胞的比例调整为1：1。 

2.3以50~120转/分钟的速度旋转样品，并在室温下孵育30分钟。 

2.4用T细胞培养基或含有1% HSA的PBS稀释珠子和细胞的混合物，以确保磁选的分离体积。然后将管子放在磁铁上1~2分钟。 

2.5移除上清液，然后用含有300 IU/mL IL-2的T细胞培养基重新悬浮珠子和细胞的混合物，并将细胞密度调整为0.5×10^6个细胞/毫升~1×10^6个细胞/毫升。 2.6将细胞悬浮液放入37℃、5% CO2的培养箱中。  

3. T细胞的激活和扩增：

3.1每天从培养的第3天开始计算T细胞的数量。 

3.2在细胞扩增的后期，定期轻轻吹动培养中的细胞悬浮液，以分离珠子和细胞。 

3.3当CD3+ T细胞数目>1×10^6个细胞/毫升时，加入含有IL-2的T细胞培养基稀释细胞，并将细胞密度调整到约0.5×10^5个细胞/毫升。 

3.4在培养结束时（第9-14天），计算细胞数目，并用磁铁去除珠子。  

实验结果

分离CD3细胞：PBMC与CD3/CD28抗体偶联磁珠（货号C-BETA2001）按照3：1的比例孵育30分钟，然后用流式细胞术分析阳性(分离)部分的分离效率。

激活纯化的CD3+ T细胞：用CD3/CD28抗体偶联磁珠（货号C-BETA2001）激活纯化的人CD3+ T细胞， 孵育48小时后，用APC标记的抗人CD25抗体和PE标记的抗人CD69抗体对细胞进行荧光染色，并用流式细胞术进行分析。

纯化的CD3+T细胞扩增。用CD3/CD28抗体偶联磁珠（货号C-BETA2001）刺激纯化的人CD3+T细胞。细胞在含有3001U/mL IL-2的T细胞培养基中扩增。活化后的细胞扩增时间可达13天(左)，细胞存活率较高(右)。   

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