Tymora：无需抗体的磷酸化蛋白检测试剂盒

发布者：艾美捷科技发布时间：2024-09-27

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解析文章：《Autophosphorylation Inhibits RcCDPK1, a Dual-Specificity Kinase that Phosphorylates Bacterial-Type Phosphoenolpyruvate Carboxylase in Castor Oil Seeds》

作者：Ryan Kilburn, Suzanne A Gerdis, Yi-Min She, Wayne A Snedden, William C Plaxton

链接：https://academic.oup.com/pcp/article/63/5/683/6542805?login=false

一、背景

在植物生物学研究中，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PEPC）作为中心代谢途径中的关键酶，在调节植物碳固定和能量代谢方面发挥着重要作用。特别是细菌型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（BTPC）在蓖麻种子发育过程中高度表达，并作为一种重要的代谢调控酶。研究表明，蓖麻中的RcCDPK1（Ricinus communis Ca²⁺-dependent protein kinase 1）是一种钙依赖的蛋白激酶，能够在Ser451位点磷酸化BTPC，从而抑制其活性。这一发现揭示了钙信号与植物代谢途径之间的潜在联系。

然而，尽管对CDPK（钙依赖蛋白激酶）的研究已经取得了显著进展，但其自磷酸化（autophosphorylation）的具体功能和调控机制尚不完全清楚。特别是自磷酸化对CDPK催化活性的影响存在争议，一些研究认为自磷酸化激活了CDPK的转磷酸化（transphosphorylation）活性，而另一些研究则发现自磷酸化具有抑制作用。因此，深入探讨RcCDPK1的自磷酸化机制对于理解其在植物代谢调控中的作用具有重要意义。

二、方法

为了研究RcCDPK1的自磷酸化特性及其对其催化活性的影响，本文采用了多种分子生物学和生物化学方法，包括基因克隆、蛋白表达与纯化、LC-MS/MS磷酸化位点分析、体外激酶活性测定等。

基因克隆与表达：将RcCDPK1及其突变体的基因克隆到表达载体中，并在大肠杆菌中进行异源表达。通过镍离子亲和层析纯化得到重组蛋白。

磷酸化位点分析：利用LC-MS/MS技术对高度自磷酸化的RcCDPK1进行磷酸化位点分析，共鉴定出42个磷酸化位点，包括丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基。

体外激酶活性测定：通过体外激酶反应测定不同磷酸化状态的RcCDPK1对其底物BTPC的转磷酸化活性。使用放射性同位素标记的ATP和非放射性ATP分别进行定量和定性分析。

pIMAGO试剂盒的应用：在激酶活性测定过程中，采用Tymora品牌的pIMAGO试剂盒对磷酸化蛋白进行检测。该试剂盒利用荧光团标记的生物素结合磷酸化蛋白，通过荧光检测实现对磷酸化水平的定量分析。在本文中，pIMAGO试剂盒被用于验证RcCDPK1的自磷酸化状态及其对BTPC转磷酸化活性的影响。

三、实验

RcCDPK1的自磷酸化分析：通过LC-MS/MS技术鉴定出RcCDPK1的多个磷酸化位点，包括Tyr30等关键残基。进一步研究表明，Tyr30的自磷酸化对RcCDPK1的催化活性具有重要影响。

自磷酸化对RcCDPK1催化活性的影响：通过体外激酶活性测定发现，高度自磷酸化的RcCDPK1对其底物BTPC的转磷酸化活性显著降低。然而，当Tyr30位点发生突变时，RcCDPK1的催化活性部分恢复，表明Tyr30的自磷酸化在抑制RcCDPK1活性中起到关键作用。

pIMAGO试剂盒在激酶活性测定中的应用：在激酶反应过程中加入pIMAGO试剂，通过荧光检测实时监测磷酸化水平的变化。结果表明，pIMAGO试剂盒能够准确反映RcCDPK1的自磷酸化状态和其对BTPC的转磷酸化活性。此外，该试剂盒还具有良好的定量能力和线性灵敏度，能够实现对磷酸化蛋白的敏感和特异性检测。