Tymora：PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

解析文章：《Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define putative diagnostic biosignatures for Parkinson’s disease》

作者：Marco Hadisurya¹ , Li Li ² , Kananart Kuwaranancharoen ³ , Xiaofeng Wu ⁴ , Zheng-Chi Lee ^1,5 ,Roy N. Alcalay 6 , Shalini Padmanabhan ⁷ , W. Andy Tao ^1,2,4,8,9 ? & Anton Iliuk^1,2 ?

链接：https://www.nature.com/articles/s43856-023-00294-w

一：背景

帕金森病（Parkinson's Disease, PD）是一种进行性神经退行性疾病，主要由于大脑中的多巴胺能神经元死亡导致。PD的早期诊断对于及时干预和治疗至关重要，但目前主要依赖于临床症状，缺乏可靠的早期诊断生物标志物。本文研究了尿液中细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）的蛋白质组和磷酸蛋白质组，以期发现潜在的PD早期诊断生物标志物。

二：研究目的

本文旨在通过分析来自健康个体、携带LRRK2 G2019S突变但未发病的非表现型携带者（NMC）、散发性PD患者（iPD）以及携带LRRK2 G2019S突变的PD患者（LRRK2PD）的尿液样本，利用蛋白质组学和磷酸蛋白质组学技术，寻找PD的诊断生物标志物。

三：方法

样本收集与处理

样本来源：来自哥伦比亚大学欧文医学中心（Columbia University Irving Medical Center, CUIMC）的138份尿液样本，分为健康对照组（Control）、非表现型携带者组（NMC）、散发性PD组（iPD）和携带LRRK2 G2019S突变的PD组（LRRK2PD）。

EV分离：使用EVtrap方法进行尿液EV的高效富集。EVtrap基于功能化磁性微珠，对脂质双层膜包裹的EV具有独特的亲和力。

蛋白质提取与消化：通过化学亲和法裂解干燥的EV，提取蛋白质并进行消化。

LC-MS分析

磷酸肽富集：使用Tymora Analytical Operations品牌的PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit（货号：707）对磷酸肽进行富集。该试剂盒通过高亲和力的树状分子与磷酸基团的相互作用，高效地从复杂的蛋白质消化产物中分离磷酸肽。

LC-MS检测：将富集的磷酸肽和直接消化的肽段分别进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析，采用数据依赖模式进行质谱扫描。

生物信息学分析

数据搜索与鉴定：使用Byonic和Sequest搜索引擎对质谱数据进行搜索，利用Proteome Discoverer软件进行数据处理。

定量与统计分析：通过Label-free定量方法对所有检测到的蛋白质和磷酸蛋白质进行定量，并进行统计学分析以发现潜在的生物标志物。

机器学习与模型训练

特征选择与模型训练：利用Python和多种机器学习库（如scikit-learn, XGBoost等）进行特征选择和模型训练，通过随机森林分类器进行10折交叉验证，评估模型的预测能力。

四：实验结果

蛋白质与磷酸蛋白质鉴定

蛋白质组学：共鉴定出4476种独特蛋白质，来自46,240个肽段。

磷酸蛋白质组学：共鉴定出2680种独特磷酸蛋白质，来自10,620个磷酸肽段。

潜在的生物标志物

上调蛋白质与磷酸蛋白质：发现多种在PD组中显著上调的蛋白质和磷酸蛋白质，这些蛋白质涉及PD的重要通路，如自噬、神经元细胞死亡、神经炎症和淀粉样纤维形成。

机器学习选定的顶级生物标志物：通过机器学习和交叉验证，选定了六个顶级生物标志物（PCSK1N, HNRNPA1, pPLA2G4A, pLTB4R, pPRR15, pPPFIA1），这些标志物在PD患者中显著上调，具有较高的诊断准确性（AUC=94.3%）。

PolyMAC试剂盒的作用与价值

高效富集磷酸肽：PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit通过其独特的树状分子结构，实现了对磷酸肽的高效选择性富集，显著提高了磷酸蛋白质组学分析的灵敏度和深度。

提高数据质量：磷酸化修饰直接反映了细胞的生理状态，特别是在神经退行性疾病中。PolyMAC试剂盒的应用使得尿液EV中的磷酸蛋白质组能够被全面、准确地解析，为PD早期诊断生物标志物的发现提供了有力支持。

促进非侵入性诊断技术的发展：尿液作为易于获取的非侵入性生物样本，结合PolyMAC试剂盒的高效磷酸肽富集技术，为PD等疾病的早期诊断提供了新的可能性。

五：结论

本文通过尿液EV的蛋白质组和磷酸蛋白质组学分析，结合机器学习技术，成功发现了多个潜在的PD早期诊断生物标志物。

PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit在磷酸肽的高效富集方面发挥了关键作用，提高了磷酸蛋白质组学数据的覆盖度和准确性，为PD等复杂疾病的生物标志物发现提供了有力的技术支持。这些发现不仅有助于PD的早期诊断，还可能为疾病机制的研究和新型治疗药物的开发提供重要线索。

六：未来展望

未来的研究将进一步验证这些潜在生物标志物的临床价值，并通过更大规模的队列研究来评估其诊断效能。此外，随着技术的不断进步，尿液EV磷酸蛋白质组学有望在更多疾病的早期诊断中发挥重要作用，成为精准医疗领域的重要工具。

Tymora品牌PolyMAC Phosphopeptide Enrichment Kit

货号：707-96 富集磷酸化蛋白

PolyMAC 基于金属离子功能化的可溶性纳米聚合物，在均匀的水环境中螯合磷酸肽。与目前基于固相微米和纳米颗粒的策略相比，PolyMAC 表现出出色的重现性、卓越的选择性、快速的螯合时间以及从复杂混合物中高的磷酸肽回收率。

从这段描述中可以看出 PolyMAC 的几个显著优势：

一、出色的重现性

意味着在不同的实验条件下或者由不同的实验人员进行操作时，都能得到较为一致的结果。这对于科学研究的可靠性和可重复性至关重要，能够减少实验误差，提高研究结果的可信度。

二、卓越的选择性

可以更精准地从复杂混合物中识别并结合磷酸肽，减少其他非目标物质的干扰。在分析复杂生物样本时，高选择性能够确保对特定目标分子的准确检测和研究。

三、快速的螯合时间

能够提高实验效率，缩短研究周期。在现代科学研究中，时间往往是一个关键因素，快速的反应时间可以使研究人员更快地获得实验结果，加速研究进程。

四、高磷酸肽回收率

从复杂混合物中有效地回收磷酸肽意味着可以更充分地利用样本，提高分析的灵敏度和准确性。对于低丰度的磷酸肽，高回收率尤为重要，可以确保对这些关键生物分子的检测和研究。

综上所述，PolyMAC 这种基于可溶性纳米聚合物的技术在磷酸肽的分析和研究中具有很大的潜力，有望为相关领域的研究提供更高效、更可靠的方法。