Norgen Biotek：Total RNA Purification Kits

文献标题：Replicative senescence and high glucose induce the accrual of self-derived cytosolic nucleic acids in human endothelial cells

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41420-024-01954-z

研究背景：

细胞衰老（Replicative Senescence）是指细胞失去分裂和增殖能力的过程，这是细胞生命周期中的一个自然现象，主要由以下几个机制引起：

1. 端粒缩短：细胞每次分裂时，染色体末端的端粒会逐渐缩短，直到达到一个临界长度，此时细胞会触发衰老程序以防止进一步分裂。

2. DNA损伤累积：细胞在生命周期中会遭受DNA损伤，如氧化应激、紫外线照射等引起的损伤。当损伤累积到一定程度，超过了细胞的修复能力，细胞可能会进入衰老状态。

3. p53和p21信号通路激活：p53是一种肿瘤抑制蛋白，当检测到DNA损伤时，p53会被激活，并诱导p21的表达，p21是一种细胞周期抑制蛋白，能够阻止细胞周期的进程，导致细胞周期停滞。

4. 氧化应激：活性氧（ROS）的积累可损伤脂质、蛋白质和DNA，导致细胞功能障碍和衰老。

5. 表观遗传改变：DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学改变在细胞衰老中也扮演重要角色。

6. 细胞内物质累积：随着时间的推移，细胞内可能会积累一些无法降解或排出的物质，如蛋白质聚集体和脂褐素，这些物质的累积会影响细胞的正常功能。

7. 细胞器功能下降：随着细胞衰老，线粒体等细胞器的功能可能会下降，导致ATP产生减少和氧化应激增加。

8. 促炎性分泌表型（SASP）：衰老细胞会分泌多种促炎性细胞因子、生长因子和酶，这些物质可以影响周围细胞和组织的功能，参与慢性炎症和组织修复。

细胞衰老（replicative senescence）和高葡萄糖水平如何影响人内皮细胞（human endothelial cells, ECs）中细胞质核酸（cytosolic nucleic acids）的积累。衰老细胞失去复制能力并会获得促炎性分泌表型，这与细胞质中核酸的积累有关。这些核酸的积累与老年病相关，但具体机制尚不清楚。研究集中在人内皮细胞上，因为它们在血管健康中扮演着重要角色，并且与糖尿病和心血管疾病等老年病有关。研究团队特别关注高葡萄糖浓度对这些细胞的影响，因为高葡萄糖是糖尿病体内高血糖状态的模拟。在这篇文章中，研究者特别关注了高葡萄糖条件下，如何模拟体内高血糖状态，加速内皮细胞衰老，并导致细胞质中核酸的积累，进而探讨其在衰老和糖尿病相关疾病中的作用。

研究内容：

研究了复制性衰老和高葡萄糖处理对人内皮细胞中细胞质DNA和RNA（包括双链DNA(dsDNA)、双链RNA(dsRNA)及RNA:DNA杂交分子）积累的影响；研究复制性衰老细胞表现出的生长停滞、衰老相关β-半乳糖苷酶活性增加、sirtuin-1表达下降、细胞周期调节蛋白p16(CDKN2A)的转录和翻译水平上调、端粒缩短、促炎细胞因子IL-6、IL-1β和IL-8的mRNA表达上调以及IL-6分泌增加等现象。研究了高葡萄糖处理对细胞的影响，包括端粒缩短、细胞质端粒序列的存在、衰老相关标志物的增加等；通过RNA测序分析了复制性衰老和高葡萄糖处理的细胞，以了解与衰老相关的分子机制。研究了细胞质核酸感应途径（包括RNA感应途径RIG-I和MDA5，以及DNA感应途径TLR9、cGAS、IFI16和STING）在衰老和高葡萄糖条件下的激活情况；还研究了外源性核酸（如CpG ODN和poly I:C）对衰老细胞中IL-6和IFN-β1表达的影响。

实验设计：

1. 细胞培养和处理：使用人脐静脉内皮细胞（HUVECs），将其分为对照组和衰老组，分别在正常葡萄糖（NG）和高葡萄糖（HG）条件下培养。

2. 衰老相关β-半乳糖苷酶活性检测：用于评估细胞衰老的百分比。

3. 端粒长度分析：使用定量PCR方法分析端粒长度。

4. mRNA表达分析：提取RNA并进行实时定量PCR分析，以评估特定基因的表达水平。

5. 蛋白质提取和免疫印迹分析：提取蛋白质并进行SDS-PAGE和免疫印迹分析，以评估蛋白质表达。

6. RNA测序：提取RNA并构建RNA-seq文库，进行高通量测序分析。

7. 流式细胞术和纳米粒子追踪分析：用于分析从细胞中释放的细胞外囊泡（EVs）。

8. 透射电子显微镜：用于观察细胞超微结构和EVs中的dsDNA。

这项研究提供了有关细胞衰老和高葡萄糖条件下细胞质核酸积累如何影响细胞功能的新见解，并探讨了这些变化如何与衰老相关的疾病（如2型糖尿病）联系起来。

研究结论：

1．细胞质核酸的积累：复制性衰老和高葡萄糖处理均会导致人内皮细胞（HUVECs）中细胞质核酸（包括dsDNA、dsRNA和RNA:DNA杂交分子）的积累。

2．衰老相关变化：高葡萄糖诱导的HUVECs表现出衰老样特征，包括端粒缩短、促炎细胞因子释放增加，以及细胞质中端粒、dsDNA和dsRNA的积累。

3．RNA感应途径的激活：衰老的内皮细胞中，dsRNA感受器RIG-I和MDA5的激活，以及DNA感受器TLR9的激活，而cGAS和IFI16介导的STING途径的激活则没有观察到。

4．炎症与I型干扰素反应：衰老细胞表现出增加的促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6、IL-8）产生，但没有可检测到的I型干扰素（IFN）分泌，这一现象可能部分由含有甲基腺苷的RNAs的积累解释。

5．外源性核酸对衰老细胞的影响：与未处理的细胞相比，经CpG ODN和poly I:C处理的衰老细胞显示出IL-6和IFN-β1表达的显著增加。

6．细胞外囊泡（EVs）中的DNA：在衰老的HUVECs中，可以检测到EVs释放的dsDNA，表明在压力条件下的细胞可以将核酸装载到释放到细胞外的EVs中。

7．转录组分析：与衰老相关的基因表达模式在正常和高葡萄糖水平下均表现出显著差异，揭示了衰老过程中的特定分子变化。

8．衰老与高葡萄糖条件下的核酸感应：衰老和高葡萄糖条件下，细胞对内源性核酸的感应途径发生了改变，这可能在衰老相关的炎症反应中发挥作用。

这些结论强调了细胞质核酸的积累作为衰老相关内皮细胞功能障碍的标志物，并可能在代谢紊乱和与年龄相关的疾病中发挥作用。研究结果为理解衰老过程中的分子机制提供了新的见解，并可能对治疗与衰老相关的疾病有重要意义。

在这项研究中，使用了以下Norgen Biotek的试剂：

Total RNA Purification Kits (货号17200，37500)：用于从年轻和衰老的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中提取总RNA。这个试剂套件按照生产商的说明进行使用，用于总RNA的提取和纯化。

RNAClean XP beads (货号A63987)：用于RNA的进一步纯化，去除样品中的污染物和杂质，以确保RNA的质量适合后续实验。

在这项研究中，Total RNA Purification Kits（总RNA纯化试剂盒）的主要作用是从人脐静脉内皮细胞（HUVECs）中提取和纯化高质量的RNA。具体来说，这些试剂盒用于：

1) 提取RNA：从细胞样本中提取总RNA，包括mRNA、rRNA和其他小RNA分子。

2) 纯化RNA：清除样本中的污染物，如DNA、蛋白质、脂质和其他可能干扰后续实验的分子。

3) 提高实验结果的可靠性：通过去除可能抑制或影响下游应用的污染物，确保RNA的质量和纯度，这对于准确的基因表达分析至关重要。

4) 适用于多种下游应用：纯化的RNA可用于实时定量PCR（qPCR）、RNA测序（RNA-seq）、Northern blotting等多种分子生物学技术。

在研究中，RNA的质量直接影响到实验结果的准确性和可靠性。例如，在进行RNA测序时，高质量的RNA是获得准确表达数据的关键。因此，使用Total RNA Purification Kits是确保实验成功的重要步骤。

Total RNA Purification Kits，如Norgen Biotek Kit，通常基于以下步骤来提取和纯化总RNA：

1．细胞裂解：首先，使用裂解缓冲液破坏细胞，释放细胞内容物，包括RNA。裂解缓冲液通常含有能够破坏细胞膜和蛋白质-RNA相互作用的成分，如表面活性剂和盐。

2．RNA分离：裂解后，样品通常通过离心来去除细胞碎片和蛋白质。RNA在离心过程中会与蛋白质和细胞碎片分离。

3．吸附和捕获RNA：纯化过程通常涉及将RNA吸附到固相基质上，如硅胶膜或磁珠。这可以通过特定的结合剂实现，这些结合剂能够特异性地结合RNA，而不会结合DNA或其他细胞成分。

4．清洗：吸附到固相基质上的RNA通过一系列清洗步骤来进一步纯化。这些步骤使用含有不同盐浓度和洗脱液的缓冲液，以去除污染物和杂质。

5．洗脱：纯化的RNA通过使用低盐或水性洗脱缓冲液从固相基质上洗脱下来。

6．RNA回收：RNA通常以液态形式回收，可以直接用于下游应用，如qPCR或RNA测序。

7．DNA酶处理（可选）：某些试剂盒可能包括一个步骤，使用DNA酶（DNase）处理样品，以去除任何残留的基因组DNA，确保RNA样品的纯净。

8．浓度和纯度测定：使用分光光度计或荧光计测定RNA的浓度和纯度。通常，RNA的A260/A280比值用于评估纯度，而A260/A230比值用于检测污染物。

9．稳定性：纯化的RNA通常需要在低温（如-80°C）下保存，以防止降解。

Norgen Biotek Kit特别之处在于它可能包含针对特定样品类型或应用的优化成分和步骤，以确保RNA的高质量和产量。