PCR系列

PCR，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。今天汇总PCR的知识点，例如终点PCR、定量PCR、反转录PCR等相关知识做基本介绍。

一、RNA定量

如何精准地检测到病毒（定性）？如何有效判定出样本中的病毒含量（定量）？借助分子生物学技术可以精准检测病原体，其中的一步法RT-qPCR技术可被广泛用于RNA病毒类型判定、病毒亚型判定、病毒定量及病毒突变体等方面。

一步法RT-qPCR(One-Step reverse transcription-quantitative PCR)用于以RNA为起始模板的定性和定量分析，将RNA逆转录合成cDNA的过程与靶标基因的PCR扩增于一管内依次进行，利用荧光来监控PCR扩增产物的变化，进而判断RNA初始量的技术即为一步法RT-qPCR技术。

RT-qPCR根据化学发光原理可以分为两大类：

一类为染料类，包括SYBR@Green I，通过荧光染料来指示产物的增加；

一类为探针类，包括TaqMan@探针，利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加。

二、miRNA的定量方法

常用的对miRNA的定量方法主要有两种，分别为茎环引物法、加尾法。提供基于加尾法的All-in-One miRNA qRT-PCR 系列试剂盒和验证引物，用于miRNA表达量的高效检测。

三、高GC含量PCR

在DNA（A、T、C、G）4种碱基中，鸟嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比率称为GC含量。因为G、C之间形成三对氢键，解链所需能量较高，所以模板很难打开，高GC含量（G+C≥60%）模板扩增中所面临的主要困难是模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA聚合酶在模板上的推进，而且模板上可能存在多个非特异性的引物复性位点，导致非特异性扩增，甚至很多时候扩增不出靶基因。

您还在为高GC含量PCR烦恼吗？您还在为扩增不出来结果而焦心吗？PCR试剂领军品牌Solis BioDyne可以为您轻松解决这个难题，可同时提供适合高GC含量PCR的预混液以及添加剂：

四、PCR疑难问题

1、终点PCR

终点PCR，顾名思义既是对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析，在反应过程中无法监测反应进行情况，只有反应完成后通过跑胶得到结果。

2、荧光定量PCR

实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。目前它主要通过两种方式——荧光染料或者荧光标记的探针对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，并结合相应的软件对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

3、逆转录PCR

逆转录 PCR（Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR）是一种以 RNA 为样本，RNA链被逆转录成为互补 DNA（cDNA），再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。在实际应用中，RT-PCR 分为一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR。整个反转录实验过程有三个重要的因素，分别是RNA模板、反转录时所使用的引物类型、反转录酶 。

五、转长片段PCR

传统的PCR通常只能扩增3kb以内的短片段，对于3kb以上的长片段很难进行有效扩增。

艾美捷提供相对长片段PCR的两种DNA聚合酶（FIREPol? Blend Master Mix）进行反应：一种是常规PCR反应中应用的耐热FIREPol? DNA聚合酶，它具有很强的延伸能力，依赖此酶进行链的延伸；另一种是具有3’→5’核酸外切酶活性的DNA聚合酶，它具有较好的校读功能，可以将错配的碱基切割下来重新利用第一种酶进行链的延伸。两种酶各有优缺点，充分利用第一种酶的延伸能力和第二种酶的校读功能，使两种酶在反应中相辅相成，完成长片段DNA的扩增。