AmyJet 倾心推荐IP专用二抗

发布者:艾美捷科技发布时间:2020-01-14

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       免疫沉淀 (Immunoprecipitation,IP) 是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后,再与ProteinA/G偶联的agarose或Sepharose珠子孵育,通过离心得到珠子-蛋白A/G-抗体-目的蛋白复合物,沉淀经过洗涤后,重悬于电泳上样缓冲液,煮沸5-10min,在高温及还原剂的作用下,抗原与抗体解离,离心收集上清,上清中包括抗体、目的蛋白和少量的杂蛋白。


       在免疫沉淀实验后的WB验证环节中,当使用常规的 Anti-IgG (H+L) 酶标二抗时,通常会出现对应免疫沉淀一抗变性后产生的重链(50kDa)和轻链(25kDa)两条带。如果检测的目的蛋白分子量在此附近时,就会受到这两条带的干扰。

 

免疫沉淀

 

        如何避免IP检测过程中的重、轻链干扰,AmyJet可为您提供两种方案:

 

        方案一:选择WB一抗时,选择和IP用一抗不同的种属,避免IP一抗的干扰

 

IP捕获抗体类型 WB检测时一抗类型 WB检测时二抗类型 备注说明
小鼠单抗/多抗 兔多抗 HRP-标记抗兔IgG二抗 由于 IP 捕获抗体与 WB 检测一抗属于不同种属来源抗体,故WB 检测时使用 HRP-标记抗兔 IgG 二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。
兔多抗 小鼠单抗 HRP-标记抗小鼠IgG二抗 由于IP捕获抗体与WB检测一抗属于不同种属来源抗体,故WB检测时使用HRP-标记抗小鼠IgG二抗可以有效避免重链轻链信号的影响。
小鼠多抗

 

货号 名称 应用类型
AMJ-AB2003 山羊抗兔IgG二抗,HRP标记 WB,IHC,ELISA
AMJ-AB2002 山羊抗小鼠IgG二抗,HRP标记 WB,IHC,ELISA

 

       方案二:选择只和重链或轻链反应的二抗

 

       如果目标蛋白分子量小于30KD,为了避免抗体轻链的干扰,选择重链特异性二抗;如果目标蛋白分子量大于30KD,为了避免抗体重链的干扰,选择轻链特异性二抗。

 

类型 货号 名称 应用类型
无重链干扰 AMJ-AB2016 IP™ 山羊抗小鼠IgG轻链二抗,HRP标记 WB,IP
AMJ-AB2017 IP™ 小鼠抗兔IgG轻链二抗,HRP标记 WB,IP
无轻链干扰 AMJ-AB2018 IP™ 山羊抗小鼠IgG重链二抗,HRP标记 WB,IP
AMJ-AB2019 IP™ 山羊抗兔IgG重链二抗,HRP标记 WB,IP

 

重链或轻链反应二抗

        IP实验常见问题汇总:

 

结果 原因 解析
显影信号整体很弱,荧光信号淬灭 显影液失效 通过检查显影液清澈度初判,并通过立即更换新显影液后再曝
底物失效 将PVDF膜重新TBST略洗几次,重新加合格的底物
二抗孵育过多 如果操作较快,会出现第1张胶片曝光后信号极强,而第2张起可能信号淬灭;如果操作稍慢点,甚至第1张胶片起信号基本淬灭,这种情况建议重做,降低二抗浓度、减少孵育时间
条带正确,但显影过强或过弱 上样量过大 可减小上样量、提高一抗稀释度并缩短曝光时间
上样量过小 可增加上样量、降低一抗稀释度并延长曝光时间
背景杂乱厚重,大片“黑区”,导致无法分析 一抗孵育时间过长
或浓度过高
4℃封闭过夜,一抗孵育1 hr,并可适当增加洗膜时间
Input泳道无目的带,而IP泳道有 目的蛋白丰度不高,无法直接 Western blot 检出,而 IP 能进行浓缩富集
Input泳道有目的带,而IP泳道无 该种一抗主要识别和结合靶蛋白内部的线性表位、而非暴露在外表的的线性或空间表位,故IP制样时无法有效捕获住组织或细胞中的完整结构靶蛋白
该蛋白浓度极低,导致捕获过程不仅未起到富集作用,反而因为洗涤操作,使靶蛋白损失殆尽,最后几乎无靶蛋白被洗脱下来;或lysis buffer过强;或选用了不正确的beads; 或一抗亚型为 IgM 或 IgA

 

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