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PCR疑难问题粉碎机(三)——逆转录PCR

发布者:艾美捷科技    发布时间:2020-06-30     
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     【前情回顾】PCR疑难问题粉碎机(一)——终点PCR

     【前情回顾】PCR疑难问题粉碎机(二)——荧光定量PCR

 

       逆转录 PCR(Reverse TranscriptionPCR, RT-PCR)是一种以 RNA 为样本,RNA链被逆转录成为互补 DNA(cDNA),再以此为模板通过 PCR 进行 DNA 扩增。在实际应用中,RT-PCR 分为一步法 RT-PCR 和两步法 RT-PCR。整个反转录实验过程有三个重要的因素,分别是RNA模板、反转录时所使用的引物类型反转录酶

 

       RNA模板

 

      高质量的 RNA 基本有几个参数可供参考,首先是 OD260/280 以及 OD260/230的值应该都是 2.0 左右,如果 OD260/280 小于 1.9,说明 RNA 中有一些蛋白质的残留,如果这个值大于 2.1,则很可能样本中 RNA 有一定的降解。OD260/230如果小于 2.0,说明 RNA 中含有异硫氰酸胍,酚残留,而这些物质对逆转录反应影响是非常大的。另外就是琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性,正常的 RNA一般呈现三条带,即 5s、18s、28s,其各自的亮度呈现递增状态,依据物种不同可逆转录 PCR能存在些许差异。当 RNA 出现降解时,反馈最明显的是 5s rRNA 的亮度显著提高。下图展示的分别是高质量 RNA、稍有降解以及完全降解的实例:

 

5s rRNA 的亮度

 

       反转录引物

 

      提取到了高质量的 RNA模板后,下一个需要考虑的问题便是引物的选择了。通常,反转录引物有三类,分别是 oligodT、随机引物和序列特异性引物:oligodT引物能特异性结合在含有 polyA 尾的 mRNA 末端起始反转录反应,但这一特性决定了它只能扩增含有 polyA 尾的 mRNA,而且对 RNA 模板的质量要求较高,一旦 polyA 尾发生降解,就不能被引物所识别,从而导致产物中没有相应基因的cDNA;随机引物一般含有 6-9 个随机序列的碱基,能够随机识别结合在 RNA 模板上,因此这类引物的优点在于能同所有类型的 RNA 结合,而且比较适合于含有二级结构的 RNA 及微量样本,具有较高的反转录灵敏度。

 

      但缺点在于,结合的随机性会造成 cDNA小片段较多,有时候还会对微量目的片段造成稀释;序列特异性引物,顾名思义,针对于特定的序列设计的反转录引物,用于特异性的反转录某一段序列。在实际的应用中,我们通常会研究同一个个体或细胞中不同基因表达水平的变化,因此序列特异性基因相对用的少一些。Solis BioDyn 可供的反转录预混液中可提供多种不同的引物(oligodT、随机引物、以及 oligodT 与随机引物的结合)供您选择,满足您的一切实验需求!

 

反转录引物

 

       逆转录酶

 

      Solis BioDyn 可提供两种逆转录酶:分别是 MMLV(RNase H+)和 SOLIScript(RNase H-)逆转录酶。RNase H,是一种核糖核酸内切酶,可以特异性地水解DNA-RNA 杂合链中的 RNA,不能水解单链或双链 DNA 或 RNA。

 

逆转录酶

 

类型货号名称
逆转录酶06-13-00050FIREScript KIT RNase H+ 逆转录酶
06-33-00050SOLIScript KIT RNase H- 逆转录酶
cDNA第一链合成06-17-00100FIREScript RT cDNA syntesis MIX without primers cDNA合成预混液,无引物
06-18-00100FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Oligo (dT) primer cDNA合成预混液,Oligo引物
06-19-00100FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Random primers cDNA合成预混液,随机引物
06-20-00100FIREScript RT cDNA syntesis MIX with Oligo (dT) and Random primers cDNA合成预混液,Oligo及随机引物
miRNA(加尾法)QP113All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit 2.0 miRNA cDNA 合成试剂盒
QP010All-in-OneTM miRNA qPCR Kit miRNA qPCR检测试剂盒
QP115All-in-OneTM miRNA qRT-PCR Detection Kit 2.0 miRNA qRT-PCR检测试剂盒
一步法RT-qPCR染料法QP071BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit (with ROX) RT-qPCR试剂盒,ROX
QP081BlazeTaq One-Step SYBR Green RT-qPCR Kit (without ROX) RT-qPCR试剂盒,无ROX
探针法QP076BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit (with ROX) RT-qPCR试剂盒,ROX
QP086BlazeTaq Probe One-Step RT-qPCR Kit (without ROX) RT-qPCR试剂盒,无ROX
08-65-00250SOLIScript 1-step CoV Kit RT-qPCR试剂盒
08-59-00250SOLIScript 1-step Multiplex Probe Kit (ROX) RT-qPCR试剂盒,ROX
08-61-00250SOLIScript 1-step Multiplex Probe Kit (Purple) RT-qPCR试剂盒,Purple


 

     艾美捷科技有限公司,通过提供完整的产品和服务体系、便利的客户关系和供应链管理,为生命科学研究工作者提供整体打包方案。我们的企业的核心价值观:“激情、敬业、学习、创新、合作、卓越”。激发我们内在的创造力,提供有竞争力的生物医学产品和服务,持续为客户创造最大价值是我们的企业使命。我们的企业愿景是成为受人尊重、世界一流的生物医学产品及服务供应商。

 

      作为一家具有尖端的技术实力、一流的经营管理水平和完善的市场销售体系的生物高科技企业,总部位于武汉光谷国家级高新技术开发区,服务面向全国。艾美捷科技是集进口试剂、实验室耗材销售、技术服务与合约开发为一体的专业化高科技公司,为用户提供最前沿的专业资讯、完备的产品、整合的解决方案,及优质的物流服务。为了更好的服务客户,公司组建了一支经验丰富的研发团队-艾美捷生物技术中心,进入研发生产阶段,将更优质的产品推荐给国内生物领域的同仁们!

 

      艾美捷科技与国内外优秀的生物试剂供应商保持着密切的合作关系,目前已成为众多国际知名品牌的中国总代理或一级代理,主要包括:AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、CytoNiChe、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、Matreya、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne等,可以在第一时间为用户提供最前沿的专业资讯、完备的产品及物流服务。

 

                  三点:

                     企业使命:激发我们内在的创造力,提供有竞争力的生物医学产品和服务,持续为客户创造最大价值。

                     企业愿景:成为受人尊重、世界一流的生物医学产品及服务供应商。

                     艾美捷定位:通过提供完整的产品和服务体系、便利的客户关系和供应链,为生命科学研究工作者提供整体打包方案。

                      六观:

                  价值观激情、敬业、学习、创新、合作、卓越。

 

 


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