您不曾了解系列5：全新一代的活细胞成像工具

     【前情回顾】：

     【1】您不曾了解系列：微管蛋白tubulin染色（活细胞），点击了解

     【2】您不曾了解系列2：活细胞微丝F-actin染色（兼容固定细胞），点击了解

     【3】您不曾了解系列3：活细胞DNA染色，点击了解

     【4】您不曾了解系列4：活细胞脂质染色，点击了解

       前期我们给大家推荐了Cytoskeleton的多种活细胞成像探针，这些革命性的探针简化了微管（SiR-Tubulin），F-肌动蛋白（SiR-Actin），溶酶体（SiR-Lysosome）和染色体DNA（SiR-DNA）的染色。最初的SiR探针基于专有的荧光团若丹明（SiR），将细胞骨架蛋白，溶酶体和DNA的活细胞成像引入了一个新的时代。这些具有低背景和低细胞毒性的荧光，同时具有高亮度且光稳定性的探针代表了已经使用了数十年的活细胞成像探针的重大改进。这些革命性的SiR探针具有多种优秀性能，并且相对于其他活细胞成像探针有所改进，包括：

      1.细胞通透性（无需转染）

      2.光稳定性

      3.极低的背景

      4.超分辨率显微镜兼容性（STED，SIM）

      5.远红外荧光团（与Cy5兼容）

      6.无细胞毒性

      在这里，我们很高兴向大家介绍Cytoskeleton的下一代活细胞成像探针– SPY探针。SPY探针对远红外通道中的SiR和SiR700活细胞成像探针进行了改进，同时还扩宽了荧光标记的选择范围，用于研究活细胞中的F-actin，Tubulin和DNA。现在可以在绿色，橙色，红色和远红外通道中选择各种颜色的活细胞荧光探针（请参见下面的激发和发射光谱图）。

      SPY探针充分兼容了SiR探针的所有优点，同时还做了许多实质性的改进，包括：

      1.荧光性质–背景比SiR和SIR700探针还要小

      2.多种荧光团覆盖（例如，远红色，橙色，红色和绿色）

      3.灵敏度和选择性高

      4.细胞通透性得到改善

      5.遵循与SiR相同的方案，孵育时间更短且浓度更低（探针持续时间更长，并且不影响细胞骨架动力学）

      6.无细胞毒性

SPY555-actin（Cat. ＃CY-SC202）是一种F-actin探针，性能类似于SiR-actin（Cat. CY-SC001），但在四甲基罗丹明（TMR）通道中，建议的最佳激发设置为555 nm，并且发射设置为580 nm。应使用与SiR-actin（Cat. ＃CY-SC001）相同的染色方案在标准TMR或Cy3通道中对SPY555-actin成像。厂家建议的活细胞染色条件为100 nM，持续2小时。	SPY555-微管蛋白（Cat. ＃CY-SC203）是一种微管探针，性能优于SiR-微管蛋白（Cat. ＃CY-SC007），但在四甲基罗丹明（TMR）通道中，建议的最佳激发设置为555 nm，且发射光最佳设置为580 nm。应使用与SiR-微管蛋白（Cat. ＃CY-SC002）相同的常规染色方案，在标准TMR或Cy3通道中对SPY555-微管蛋白成像。但是，由于SPY555-微管蛋白比SiR-微管蛋白具有更高的细胞渗透性，因此厂家建议的活细胞染色条件为10 nM，持续2小时。
SPY505-DNA（Cat. ＃CY-SC101）是绿色通道DNA探针，最佳激发为510 nm，发射为530 nm。SPY515-DNA应该在异硫氰酸荧光素（FITC）或黄色荧光蛋白（YFP）通道中成像，并使用与SiR-DNA（Cat. ＃CY-SC007）相同的染色方案。厂家建议的活细胞染色条件为100 nM，持续2h。	SPY555-DNA（Cat. ＃CY-SC201）是三甲基罗丹明（TMR）通道DNA探针，最佳激发为555 nm，发射为580 nm。应使用与SiR-DNA（Cat. ＃CY-SC007）相同的染色方案在TMR或Cy3通道中对SPY555-DNA进行成像。厂家建议的活细胞染色条件为100 nM，持续2h。

      我们的SPY探针的优势在哪？

      常见问题：

      Q1. 什么是STED显微镜及其工作原理？

      A1: STED显微镜是受激发射损耗显微镜（Stimulated Emission Depletion microscopy）, 它是一种超分辨率显微技术，与传统的光学显微镜相比，它可以捕获分辨率更高的图像，而传统的光学显微镜却受到光衍射的限制，STED使用2个激光脉冲，其中之一是激发脉冲，激发荧光团使其发出荧光；第二个脉冲称为STED脉冲，当激发脉冲的照射使得其衍射斑范围内的荧光分子被激发，其中的电子跃迁到激发态后，损耗光使得部分处于激发光斑外围的电子以受激发射的方式回到基态，其余位于激发光斑中心的被激发电子则不受损耗光的影响，继续以自发荧光的方式回到基态。这是通过将STED脉冲聚焦成环形来实现的，其中中心焦点没有STED激光脉冲，从而为荧光区域提供高分辨率（图1）。

图1.在人类原代皮肤成纤维细胞中用SiR-微管蛋白标记的微管的STED显微图像

       Q2. 为什么SPY肌动蛋白（或微管蛋白/ DNA）探针对STED显微镜有效？

       A2: STED显微镜可在体内以纳米摩尔量级分析细胞的细节，为了利用这种超高分辨率显微镜，必须能够以高特异性选择使用荧光探针检查的区域。此外，荧光探针必须明亮，耐光，无或几乎没有光毒，被激发并在远红色光谱中发射。另外，如果将探针用于活细胞成像，则需要探针具备很高的细胞通透性，SPY肌动蛋白和微管蛋白探针可满足所有这些要求。简而言之，STED和SiR探针的组合可实现亚细胞结构（肌动蛋白，微管蛋白，微管结构）无与伦比的荧光可视化，以及描述它们在活细胞中的物理特征（见下图）。

用SiR-Actin染色的培养大鼠海马神经元的STED图像	右边的图像是左边图像的一部分的特写视图，可以清晰地看到直径为180 nm的肌动蛋白环（条纹）

       Q3 ：SPY探针在室温下稳定吗？

      A3：探针在室温下可以稳定几天，但是，稳定性在很大程度上取决于探针和溶剂。因此，建议将所有探针或溶液保存在–20°C以下。

       Q4：SPY-肌动蛋白，SPY-DNA和SPY-微管蛋白对细胞有毒吗？

      A4：是的，超过一定阈值，两种探针均显示出对细胞增殖和肌动蛋白或微管动力学改变的影响。但是，这些探针的毒性比其母体药物低几个数量级。在HeLa细胞中，染料浓度低于100 nM肌动蛋白或微管动力学都不会发生改变，在此浓度下，SPY探针可有效标记微管和F-actin，从而捕获高信噪比的图像。

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