Gateway克隆技术高深莫测?

发布者:艾美捷科技发布时间:2020-07-28

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       提到克隆、重组载体,就想到5字金言:分、切、连、转、筛,“分”是指分离制备合格的待操作的DNA;“切”是指用序列特异的限制性内切酶切开载体DNA,或者切出目的基因;“连”是指用DNA连接酶将目的DNA同载体DNA连接起来,形成重组的DNA分子;“转”是指通过转染的方法将重组的DNA分子导入宿主细胞中进行复制和扩增;“筛”则是从宿主群体中挑选出携带有重组DNA分子的克隆。实验具体怎么做,细节大体是没印象了,但是这5个字却记得真真切切,都是血泪的教训,现在说起来貌似很简单,谁知道当初这5步历经了多少次炼狱循环。

 

      没错,在过去数十年,用限制性内切酶产生黏性末端,在DNA连接酶的作用下,连接两个甚至更多片段的克隆方法,是载体构建的经典方案。但是现如今我们再提到克隆的时候,远远不再只有传统的限制酶克隆一种选择。其中Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆方法已经流行开来。不要觉得Gateway克隆技术高深莫测,其实了解一下你就能懂。

 

      Gateway克隆方法是λ噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外形式。在体内,噬菌体(attP)和细菌(attB)的附着位点发生重组反应,噬菌体整合到细菌基因组中,两侧为两个新的重组位点(attL-left-和attR-right-)。在某些条件下,attL和attR位点可以重组,导致噬菌体从细菌染色体上切除并重新生成attP和attB位点。

 

Gateway克隆技术

 

      即Gateway技术依赖于下面描述的两个反应:BP反应和LR反应,通过BP反应获得入门克隆(有时候我们也说中间克隆),再通过LR反应将目的DNA以正确的方向连接到各种目的载体上,形成不同的表达载体。GeneCopoeia提供的 EZShuttle™重组克隆体系应用E.coli和λ噬菌体特异位点的重组酶促体系使 DNA片段在载体间相互转换,其原理与 Gateway克隆技术相同。

 

       BP反应-构建入门载体:

 

      通过PCR将attB位点添加到目的DAN序列两侧,形成attB-PCR产物。用attB-PCR产物或者含attB位点的供体质粒和含attP位点的质粒发生重组生成入门克隆。

 

BP反应-构建入门载体

 

货号 名称 说明
RCBM-1002-020 EZRecombinase™ BP Cloning Kit (20 rxn) Catalyzes attB x attP cloning(催化BP反应)
RCBM-1002-100 EZRecombinase™ BP Cloning Kit (100 rxn) Catalyzes attB x attP cloning(催化BP反应)

 

        LR反应-构建表达载体:

 

      制作表达载体时,选择适合的目标载体非常重要。这种选择取决于许多因素,如宿主类型,所需的表达水平和实验目的。选定的attR表达载体与attL-入门载体重组以产生表达载体。

 

LR反应-构建表达载体

 

货号 名称 说明
RCBM-1001-020 EZRecombinase™ LR Cloning Kit (20 rxn) Catalyzes attL x attR cloning(催化LR反应)
RCBM-1001-100 EZRecombinase™ LR Cloning Kit (100 rxn) Catalyzes attL x attR cloning(催化LR反应)

 

      除了可以提供载体构建的BP Mix和LR Mix,GeneCopoeia还可提供40,000多种人和小鼠不同载体的即用型ORF表达克隆(可直接用于体内或体外不同宿主或表达系统的蛋白表达,省却克隆构建步骤),以及20,000种人和15,000小鼠Gateway PLUS入门克隆(还需要进行亚克隆,将ORF序列转移到表达克隆中)。你的基因我承包,不管你是需要构建好的表达克隆,还是入门克隆,不要犹豫,请联系艾美捷科技,全方位科研需求的表达系统以及众多的融合标签可以满足您的花样需求

 

     全方位科研需求的表达系统

 

 

大肠杆菌表达克隆 15种
哺乳动物细胞表达克隆 48种
慢病毒表达克隆 82种
昆虫细胞表达克隆 1种
酵母表达克隆 3种
麦胚无细胞表达克隆 8种

 

       众多的融合标签

 

荧光蛋白标签 eGFP、eYFP、eCFP、mCherry
多功能标签 HaloTag®、AviTag™、SNAP- Tag™
促溶解度标签 His、Trx、SUMO、GST、MBP
抗体免疫共沉淀标签 HA、Flag、cMyc

 

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      艾美捷科技与国内外优秀的生物试剂供应商优保持着密切的合作关系,目前已成为众多国际知名品牌的中国总代理或一级代理,主要包括:AmyJet、AAT Bioquest、Abnova、Agrisera、Biovision、Biosensis、Cayman Chemical、Caisson Labs、Cytoskeleton、CytoNiChe、Epigentek、Equitech-Bio、Hycult Biotech、Jackson、LifeSensors、LigaTrap、ProSpec、Norgen Biotek、Mabtech、Matreya、iRegene、StressMarq、ImmunoReagents、SouthernBiotech、Origene、US Biological、Solis BioDyne等,可以在短时间内为用户提供专业的前沿资讯、完备的产品及物流服务。

 

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