新型双泛素底物—精准检测去泛素化酶活性

     【前情回顾】LifeSensors超全泛素及多聚泛素链

      泛素-蛋白酶体（ubiquitin-proteasome system，UPS）途径介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制。负责执行这个调控过程的组成成分包括泛素及其启动酶系统和蛋白酶体系统。泛素启动酶系统负责活化泛素，并将其结合到待降解的蛋白上，形成靶蛋白多聚泛素链，即泛素化。蛋白酶体系统可以识别已泛素化的蛋白并将其降解。此外，细胞内还有另一类形成反向调节的解离泛素链分子的蛋白酶——去泛素化酶(Deubiquitinase，DUB)。

      在UPS系统中，DUBs主要通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或异肽键,将泛素分子特异性的从链接有泛素的蛋白质或者前体蛋白上水解下来。DUBs对蛋白质的结构和泛素化的方式（如K48、K63、K11等）都具有选择性，因此不同的DUBs在调节泛素化修饰中起到了各种各样的作用。不断有研究发现许多DUBs的功能紊乱与多种疾病相关，包括癌症、神经退行性疾病、血液疾病、以及一些传染病。并且，DUBs目前也已经成为重要的药物作用靶点。DUBs活性检测的难点是合成一种适用于高通量筛选（high-throughput screening，HTS）的生理学相关底物以反映DUBs的异肽酶活性。

       当前，用于测量泛素/泛素样蛋白（Ub/Ubl）异肽酶活性的可商购试剂和检测方法是主要基于对线性肽-或酰胺键的裂解，但是这种裂解方式无法反映真实的异肽键的几何类型。另外，用于实时监测多聚泛素链降解的其他基于荧光的均相测定法需要多个酶促步骤，或者需要在泛素分子的N末端进行特异性修饰，这些处理都会破坏蛋白构象的完整性。目前的这些检测试剂和测定方法无疑还无法满足研究学者对DUBs活性检测在均一稳定性，生物学相关和高通量筛选分析上的需求。

      作为泛素研究领域的专家，LifeSensors可为您提供一种新型的双泛素底物，通过反应后的荧光读数反应DUBs活性。LifeSensors提供的双泛素分子（Diubiquitin，DiUb）是K48或K63（最广泛形式的多泛素连接）通过异肽键连接的形式。这些底物可用于确定DUBs对底物的特异性，监测DUBs介导的异肽裂解的动力学参数，以及研究多泛素化蛋白的选择性去偶联。

       这些双泛素底物是一类新的连续性试验底物，用于研究异肽键的裂解。野生型泛素C末端一般是通过异肽键与第二个泛素分子的Lys48或Lys63连接，其中一个泛素分子上标记了荧光猝灭剂，另一个泛素分子上标记了荧光报告基团，这样就形成了一个内部猝灭的能量转移荧光分子对（IQF-diubiquitins）。双泛素分子未裂解时，报告基团的荧光信号被猝灭基团吸收，检测不到荧光信号，加入DUBs后，双泛素分子底物被裂解，导致猝灭荧光基团与报告荧光基团分离，荧光信号增强。每个双泛素底物都可以在不同位点（K63-1-2-3-4-5-6或K48-1-2-3-4-5-6）进行标记，以便对特定的DUBs形成优化的双泛素底物。重要的是，荧光和淬灭基团的引入并不影响泛素分子的天然结构。通过这种生理底物检测泛素异肽酶活性的方法是对真核蛋白质组学这一重要研究领域的重大突破。

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