提高PCR扩增特异性，BlazeTaq; SYBR; PCR试剂盒了解一下

      疫情当下，最热频的词汇莫过于核酸检测了。而核酸检测最核心的技术也越来越被大众所熟知，就是我们高中就学过的聚合酶链式反应，又称为PCR。

      自从1983年，Kary Mullis才发明出这个用于扩增目标DNA的研究工具—PCR技术后，其逐渐成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。而Kary Mullis也因这一发明获得了1993年的诺贝尔化学奖。

      而熟悉PCR的同学们都知道，PCR之所以能够在短时间内将单个DNA分子扩增数百万倍以便于下游实验检测，主要依靠这三个步骤连续多次循环而实现：

    （1） DNA变性：首先对双链DNA模板进行高温加热，使DNA双链变性解离成单链；

    （2） 引物退火：被称为引物的短DNA分子与目标DNA的侧翼区域结合；

    （3） 延伸扩增：DNA聚合酶沿着模板链将引物3’端进行延伸。将这些步骤重复（“循环”）25-35次，即可按指数方式获得精确的目标DNA拷贝。

      而PCR这项核心技术的核心是强大的DNA聚合酶，其在新DNA链合成中扮演着重要的角色，是PCR反应不可或缺的组成部分，是保证PCR扩增产物特异性、热稳定性、保真度等方便的重要因素。

      而对目的基因进行PCR扩增的过程中，延伸错配的非特异产物和引物二聚体的产生是PCR实验中常遇到的问题，这些都与DNA聚合酶有关。因为这种非特异扩增会显著降低目的基因扩增的产率和灵敏度，从而影响扩增结果的合理解释和下游实验应用的成功。

       那么，问题来了，如何减少非特异性扩增？

      方案之一：在冰上配制PCR反应，这是我们经常的操作。因为这样有助于将DNA聚合酶的活性保持在低水平。

      但在PCR开始之前，依然可能会合成不需要的产物。

       另一个办法是将DNA聚合酶的加入时间推迟到第一个循环的退火步骤。因为只有在90℃以上的初始变性步骤之后才能开始扩增，所以该技术被称为“热启动”。所以后来为了避免非特异性扩增，科学家们开始进行手动热启动PCR反应，但是这个过程不仅费时费力，而且会增加样品污染和降低实验可重复性的风险。

      后来，人们发明了具有热启动特性的DNA聚合酶，既抗体修饰的DNA聚合酶。

      这种DNA聚合酶通过对酶活性位点抗体修饰，抑制其在室温下的活性，在初始高温变性步骤（如，>90℃）阶段，结合的抗体失活，从而激活DNA聚合酶。

      由于DNA聚合酶在室温下的活性被抑制，所以，热启动技术为在室温下配制多个PCR反应体系提供了极大的便利，且不会影响特异性和扩增能力

      而BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0系列PCR试剂盒既是基于抗体修饰法的qPCR定量检测试剂盒。

      BlazeTaq™ SYBR^® Green qPCR mix 2.0系列试剂盒采用了新型抗体修饰的BlazeTaq™热启动DNA聚合酶，室温时酶的活性被抗体完全封闭，更有效地抑制非特异性扩增；反应时只需95°C预变性30 s即可使酶完全被激活，可明显地缩短qPCR反应时间。此外，优化的Buffer体系显著提高Real Time PCR反应的灵敏度和重复性，同时具有扩增效率高、特异性强、检测范围广的特点，并能有效抑制引物二聚体的产生，使实验结果更加可靠。

      本产品提供了一种通用的反应条件及实验操作流程，且推出带有、或不带有ROX参比染料的两个版本供用户选择，适用于大多数荧光定量 PCR 仪。

       产品优势

      灵敏度高：可检测低至5个拷贝数的DNA模板

      特异性强：抗体修饰热启动DNA聚合酶，更有效抑制引物二聚体以及非特异性扩增的产生

      扩增效率高：在宽广的GC含量范围内能维持高扩增效率

      操作简单：预先配好的5×预混液，反应前只需加入模板、引物、灭菌水

      适用性广：提供带有或不带有ROX的两个版本可选，适用于大多数荧光定量PCR仪

      图1. 使用BlazeTaq™ SYBR^® Green qPCR mix 2.0扩增8个10倍梯度稀释的双链DNA片段，DNA拷贝数范围为5×10⁷~5个拷贝。如图所示，试剂盒显示出高灵敏度的特性，在宽广的定量范围内具有优异的线性相关性。

        竞品产品性能对比：

      图2.使用Hela细胞系的梯度稀释的cDNA扩增B2M基因。BlazeTaq™（红色）与BioRad SsoAdvanced™ Universal SYBR^® Green Supermix（蓝色）的性能对比显示在相似扩增性能下，前者具有更强的信号。

       图3. BlazeTaq™（红色）与Powerup™ SYBR Green Master Mix（绿色）和Promega（蓝色）GoTaq^® QPCR Master Mix（绿色）的性能对比显示，其灵敏度、扩增效率和特异性更高。

      图4. Ct值比较。 使用BlazeTaq™（蓝色），Applied Biosystems的PowerUp™ SYBR Green Master Mix（橙色）和来自Promega的GoTaq^® qPCR Master Mix（灰色）扩增来自10 ng HeLa cDNA的41个基因。

      图5.使用BlazeTaq™ SYBR^® Green qPCR mix 2.0分别扩增50个和5个拷贝数的同一个DNA模板，并设无模板对照（NTC组），每组qPCR反应重复24次。结果显示，试剂盒对低浓度模板的扩增实验重复性好。cDNA的41个基因。

      图6. 使用BlazeTaq™ SYBR® Green qPCR mix 2.0分别扩增不同GC含量（GC含量范围在39.3~61.2%之间）的DNA模板。结果显示，各模板的扩增效率仍能维持在90%~110%之间，表明试剂盒对GC含量在一定范围内的DNA模板适用性广。

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